馬婧怡 田 冰 王 鑫 陶曉奇

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715;2. 國家級食品科學(xué)與工程實驗教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶 400715)

卡那霉素(kanamycin)是從鏈霉菌或小單胞菌培養(yǎng)液中提取，或以天然品為原料半合成提取而獲得的一種堿性氨基糖苷類抗生素[1]，主要通過抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成而起到殺滅細(xì)菌的作用。其能夠抑制葡萄球菌、巴氏桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌的生長繁殖，常被用于治療畜禽細(xì)菌感染[2-4]。由于廉價且抗菌性好的特點，卡那霉素被作為獸藥在畜禽養(yǎng)殖中廣泛使用，但濫用會導(dǎo)致其在動物性食品中殘留超標(biāo)，長期攝入將對人體產(chǎn)生腎毒性、造血系統(tǒng)毒性等毒副作用[5-6]，如2012年的“速成雞”事件[7]。中國、歐盟、日本以及美國均制定了動物性食品中卡那霉素的最高殘留限量(MRLs)，歐盟規(guī)定MRLs為：肉類100 μg/kg、肝臟600 μg/kg、腎臟2 500 μg/kg、牛奶150 μg/kg[8]；中國的GB 31650—2019中規(guī)定MRLs為：肌肉100 μg/kg、皮脂100 μg/kg、肝臟600 μg/kg、腎臟2 500 μg/kg、奶150 μg/kg。因此，為規(guī)范養(yǎng)殖業(yè)中卡那霉素的使用及維護(hù)食品安全，建立快速且準(zhǔn)確的檢測方法具有重要意義。

目前，卡那霉素殘留的檢測方法有儀器分析法和免疫分析法。儀器分析法主要有高效液相色譜法(HPLC)[9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[11]等，這類方法靈敏度高，但設(shè)備昂貴、檢測程序復(fù)雜且對試驗人員要求較高[12]?；谔禺愋陨镒R別元件的免疫分析方法，因具有快速靈敏、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品檢測中，其常用的特異性生物探針有抗體和適配體。抗體作為一種傳統(tǒng)的免疫分析方法識別元件，其生產(chǎn)成本高、周期長、免疫活性不穩(wěn)定且修飾標(biāo)記復(fù)雜[13-14]。核酸適配體作為一種新型識別元件，是經(jīng)體外篩選技術(shù)(SELEX)篩選出的具有目標(biāo)物特異性識別功能的單鏈DNA或RNA，由于其生產(chǎn)成本低、合成快、親和力強(qiáng)、穩(wěn)定且易于修飾標(biāo)記，近年來在食品檢測領(lǐng)域中迅速發(fā)展[15]。文章擬對動物性食品中卡那霉素殘留的核酸適配體檢測方法進(jìn)行綜述，總結(jié)其發(fā)展現(xiàn)狀，并展望其未來發(fā)展方向，以期為保障食品安全，建立簡便快速的檢測方法提供依據(jù)。

1 核酸適配體

核酸適配體是一段能與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的單鏈DNA或RNA序列，一般由10～100個核苷酸堿基組成，可以特異性結(jié)合酶、抗體、金屬離子、生物毒素等的靶標(biāo)分子。由于性能優(yōu)越，其常被用于快速高效地檢測動物性食品中抗生素殘留[16-17]。近年來，基于適配體檢測動物性食品中卡那霉素殘留所使用的適配體序列如表1所示。由表1可知，可用于檢測的適配體種類較少，而且在大多數(shù)檢測方法中都使用了5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3'這一適配體序列，其親和性被普遍認(rèn)同，且此適配體用于卡那霉素檢測中，大約有82%的文獻(xiàn)使用了該序列。但有研究[35]表明，5'-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3'這一最常用的適配體序列似乎不能與卡那霉素發(fā)生特異性結(jié)合；同時，有關(guān)聯(lián)合使用納米金(AuNPs)與適配體用于卡那霉素的檢測方法中，忽略了AuNPs與靶標(biāo)分子間(卡那霉素)的相互作用，卡那霉素可強(qiáng)烈吸附在AuNPs上。基于核酸適配體檢測卡那霉素殘留時，常用標(biāo)記適配體、核酸擴(kuò)增、與納米材料聯(lián)合應(yīng)用等方法提高其靈敏度，而對適配體的探索與改進(jìn)卻較少。而改良的SELEX可篩選出性能更好的適配體，并且更加經(jīng)濟(jì)高效[36]，為適配體的商業(yè)化應(yīng)用提供了可能；Zhang等[37]設(shè)計出提供多個結(jié)合位點的多價適配體，增強(qiáng)了對目標(biāo)分子的親和力，為適配體檢測方法的改進(jìn)提供了新策略。

2 檢測方法

目前，基于核酸適配體檢測動物性食品中卡那霉素殘留的檢測方法主要包括比色法、熒光法、電化學(xué)法、表面增強(qiáng)拉曼散射法等。

2.1 比色法

比色法是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色來分析待測物質(zhì)含量的一種方法，該方法無需復(fù)雜昂貴的檢測設(shè)備，只需利用分光光度計進(jìn)行檢測，具有操作簡便、檢測快速且檢測結(jié)果肉眼可見等優(yōu)點。常見的比色法有兩類：利用AuNPs聚集顯色和利用過氧化物酶活性催化顯色。

2.1.1 基于納米金聚集顯色 核酸適配體易于修飾標(biāo)記，這使得檢測方法靈活多樣，尤其是與AuNPs的聯(lián)用最為廣泛，適配體可通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合在AuNPs表面，當(dāng)AuNPs被某種條件誘發(fā)時會產(chǎn)生聚集，此時由于表面等離子體共振吸收(SPR)的變化會呈現(xiàn)出與分散狀態(tài)下不同的光學(xué)性質(zhì)[38]，通過檢測加入目標(biāo)物質(zhì)前后溶液顏色的變化，即可分析目標(biāo)物質(zhì)含量。

AuNPs的聚集可以由多種因素誘發(fā)，如利用AuNPs表面的修飾探針與適配體雜交，形成AuNPs/探針/適配體聚合物，導(dǎo)致AuNPs聚集?；谶@一原理，Zhou等[18]利用與適配體3'端和5'端分別互補(bǔ)的兩種單鏈DNA(ssDNA1/ssDNA2)修飾AuNPs，適配體與這兩種功能化AuNPs一起孵化時會形成聚合物(AuNPs/ssDNAs/適配體)，當(dāng)卡那霉素存在時，適配體會與卡那霉素結(jié)合從而競爭性解離AuNPs聚合物，并使溶液的紫外可見光譜發(fā)生改變。該方法具有良好的特異性與準(zhǔn)確性，檢測范圍為1～500 nmol/L，檢測限為1 nmol/L，可用于牛奶樣品中卡那霉素殘留物的檢測,但該方法功能化AuNPs的表面修飾和分離過程復(fù)雜繁瑣，檢測效率低。

表1 卡那霉素的適配體序列Table 1 The aptamer sequence of kanamycin

利用高濃度的鹽誘導(dǎo)AuNPs聚集的檢測方法則無需復(fù)雜的修飾分離過程，能有效提高檢測效率。張彩艷等[19]利用這一原理對牛奶中的卡那霉素殘留進(jìn)行了檢測，試驗原理如圖1(a)所示。當(dāng)樣品中無卡那霉素時，核酸適配體與其互補(bǔ)單鏈DNA形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，加入卡那霉素后，核酸適配體與卡那霉素結(jié)合，釋放出互補(bǔ)單鏈DNA吸附于AuNPs表面，導(dǎo)致AuNPs在高鹽條件下仍能保持穩(wěn)定，顏色不會發(fā)生改變。該方法具有良好的選擇性與靈敏度，線性范圍為0.02～0.30 μmol/L，檢出限為8 nmol/L，同樣無需對AuNPs表面進(jìn)行修飾，Li等[20]基于魚精蛋白與AuNPs間存在很強(qiáng)的靜電相互作用，設(shè)計了一款基于外切酶I(Exo I)輔助信號放大和魚精蛋白誘導(dǎo)AuNPs聚集的傳感器，利用外切酶輔助有效放大了傳感器產(chǎn)生的信號以實現(xiàn)超靈敏檢測，該方法選擇性極佳，線性范圍為0.000 1～10.000 0 nmol/L，檢測限為0.028 pmol/L，并且檢測時只需將適配體/互補(bǔ)DNA雙鏈探針、目標(biāo)物、魚精蛋白和AuNPs簡單均勻混合到溶液中，操作步驟簡單。

雖然依據(jù)AuNPs聚集與否的比色法具有很多優(yōu)勢，但當(dāng)適配體不存在時，卡那霉素可直接吸附到未經(jīng)修飾的AuNPs上，干擾其表面的電荷分布，產(chǎn)生假陽性比色信號[39]，且AuNPs易受復(fù)雜反應(yīng)體系影響產(chǎn)生非特異性聚集變色[40]，這些干擾因素在設(shè)計檢測方法時不可忽視。

2.1.2 基于過氧化物酶活性催化顯色 此類顯色反應(yīng)常以酶催化氧化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)[41]。天然酶如辣根過氧化物酶(HRP)常被用于催化H2O2-TMB體系顯色，其催化效率高、專一性強(qiáng)，但易受物理和化學(xué)因素影響而失活。鑒于此，利用納米酶或脫氧核酶(DNAzyme)模擬過氧化物酶活性催化H2O2-TMB體系顯色的方法，在食品檢測領(lǐng)域快速發(fā)展[42]。

相比于天然酶，納米酶具有高效、穩(wěn)定、易獲得等優(yōu)勢，是最具前景的天然酶替代材料之一?；诩{米酶的比色法具有穩(wěn)定、方便的優(yōu)點。Tang等[21]利用碳基納米材料模擬過氧化物酶活性，設(shè)計了比色傳感器用于檢測卡那霉素殘留，其試驗原理如圖1(b)所示。該方法中游離卡那霉素適配體(Ky2適配體)通過范德華力吸附在二硫化鎢(WS2)納米片表面，提高納米酶與TMB的親和力，導(dǎo)致分層WS2納米片的過氧化物酶模擬活性顯著提升，催化H2O2-TMB體系轉(zhuǎn)化為藍(lán)色。加入卡那霉素后，Ky2適配體與卡那霉素優(yōu)先結(jié)合，進(jìn)而從WS2上脫離下來，不再增強(qiáng)WS2納米片的過氧化物酶模擬活性，溶液呈淺藍(lán)色甚至無色。這種傳感器平均回收率為93.0%～110.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為3.5%～8.7%，線性范圍為0.1～0.5 μmol/L，檢測限達(dá)0.06 μmol/L，且WS2納米片具有良好穩(wěn)定性(貯藏1～2年催化活性幾乎不受影響)及可重復(fù)使用性(6個循環(huán)后保持約85%的催化活性)。Liu等[22]利用貴金屬納米酶模擬過氧化物酶活性，設(shè)計了基于適配體的切口酶輔助信號放大的超靈敏比色傳感器。該試驗制備了一種含有DNA適配體的發(fā)夾探針，當(dāng)卡那霉素存在時，探針中的靶DNA會游離出來與信號探針雜交，此時切口酶切割信號探針釋放出鉑納米顆粒(PtNPs)，靶DNA則進(jìn)入下次循環(huán)，磁分離后積累的大量PtNPs將催化H2O2-TMB體系顯示藍(lán)色。此方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差約為3.63%，靈敏度與選擇性良好，檢測極限為0.000 2 μg/kg遠(yuǎn)低于需檢測水平150 μg/kg。雖然納米酶具有諸多優(yōu)勢，但是與天然酶相比其選擇性方面仍有欠缺，且大多數(shù)納米酶活性較低[43]，因此發(fā)展種類更為廣泛且性能較好的納米酶對檢測技術(shù)的進(jìn)步具有重要意義。

圖1 基于卡那霉素適配體的比色法檢測卡那霉素Figure 1 Determination of the aptasensor for detection of kanamycin based on colorimetric methods

利用具有催化功能的DNAzyme模擬過氧化物酶活性同樣可以催化H2O2-TMB體系顯色，Chen等[23]將具催化功能的DNAzyme(S1)與卡那霉素適配體(S2)雜交來抑制S1過氧化物酶催化活性，當(dāng)加入卡那霉素時，適配體與卡那霉素特異性結(jié)合，釋放出S1催化H2O2-TMB體系變色，同時由于S2與卡那霉素結(jié)合形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其發(fā)夾尾部可以與單鏈核苷酸(S3)進(jìn)行互補(bǔ)配對，觸發(fā)外切酶III(Exo III)切割S2，釋放卡那霉素進(jìn)行目標(biāo)物回收使S1數(shù)量增多，從而起到放大信號的作用。最佳條件下，該方法回收率為91.1%～109.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)差低于9.3%，吸光度和卡那霉素質(zhì)量濃度對數(shù)值在0.000 1～10.000 0 μg/L內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測極限約為0.045 pg/mL，具有很好的可重復(fù)性，并且該方法中所有反應(yīng)都在均勻系統(tǒng)中一步進(jìn)行，無需費(fèi)時費(fèi)力的表面修飾、孵化及復(fù)雜納米材料的合成等過程，具有成本較低且無需復(fù)雜標(biāo)記的突出優(yōu)勢。

比色法簡便快速、成本較低，且具有檢測結(jié)果可直接用肉眼進(jìn)行觀察的優(yōu)勢，但是存在檢測中干擾嚴(yán)重、靈敏度低、需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程等缺點。其常常利用AuNPs聚集與過氧化物酶活性催化顯色，但AuNPs的聚集易受干擾[39-40]，且納米酶與DNAzyme存在活性與特異性欠佳等問題[43]，因此局限了比色法在卡那霉素檢測中的應(yīng)用。

2.2 熒光法

熒光法是基于一些熒光物質(zhì)能夠在一定激發(fā)波長下發(fā)出熒光的原理，通過檢測熒光強(qiáng)度的變化來對物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的方法[15]，對試驗儀器要求低、靈敏度高且受外界影響小[44]。核酸適配體具有易被修飾標(biāo)記的優(yōu)良特性，常對核酸適配體或其互補(bǔ)鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記，因此往往可以根據(jù)是否進(jìn)行熒光標(biāo)記將熒光法分為熒光標(biāo)記型和熒光非標(biāo)記型。

2.2.1 熒光法標(biāo)記型 熒光標(biāo)記型檢測方法需要對探針進(jìn)行熒光標(biāo)記。常用的核酸適配體熒光標(biāo)記材料有熒光染料、量子點和貴金屬納米簇等[15]。Deng等[24]利用熒光染料Cy3、Cy5標(biāo)記的核酸鏈對卡那霉素進(jìn)行檢測，其中聚合酶催化擴(kuò)增(PCA)和催化發(fā)夾自組裝(CHA)兩個循環(huán)信號放大過程大大提高了靈敏度及選擇性，檢測原理如圖2(a)所示。第1個過程中適配體與其部分互補(bǔ)DNA鏈(cDNA)雜交，當(dāng)加入卡那霉素后釋放出cDNA與模板DNA鏈(pDNA)雜交，并在聚合酶作用下從cDNA的3'端以pDNA為模板進(jìn)行聚合，新生成的序列可通過內(nèi)切酶切割而釋放出復(fù)制DNA鏈(H0)。第2個過程由H0觸發(fā)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA鏈H1的3'端被Cy3標(biāo)記而發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA鏈H2的5'端被Cy5標(biāo)記，H0存在時可打開H1、H2鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成H1/H2雙鏈，并釋放H0繼續(xù)進(jìn)行信號循環(huán)放大，H1/H2的雙鏈結(jié)構(gòu)使Cy3、Cy5互相接近，產(chǎn)生基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理的熒光信號。該傳感器回收率為88.1%～100.2%，在1.0～80.0 nmol/L內(nèi)具有良好的線性相關(guān)關(guān)系(R2=0.990 1)，檢測限低至0.29 nmol/L，在牛奶樣品中取得了良好的檢測結(jié)果。同樣基于FRET檢測原理，Ha等[25]將熒光基團(tuán)6-羧基熒光素(FAM)作為供體，還原氧化石墨烯(rGO)作為受體，設(shè)計了一種熒光傳感器。將適配體的5'端用FAM標(biāo)記，其可以通過π—π鍵吸附于rGO表面而導(dǎo)致FMA熒光淬滅，當(dāng)卡那霉素存在時則會誘導(dǎo)FAM標(biāo)記的適配體從rGO表面脫落，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。這種檢測方法快速、靈敏，線性范圍為1.0～20.0 pmol/L，檢測極限為1 pmol/L，并且所有試驗過程不超過1 h，可用于快速檢測卡那霉素殘留。標(biāo)記型的熒光法需要對探針進(jìn)行熒光標(biāo)記，雖然這種檢測方法更為靈敏，卻存在標(biāo)記過程復(fù)雜費(fèi)時、不同批次的探針間可能存在差異等弊端。

2.2.2 熒光法非標(biāo)記型 非標(biāo)記型的熒光法無需進(jìn)行熒光標(biāo)記，不僅簡化了試驗還避免了探針間可能存在的差異。Yang等[26]基于N-甲基卟啉二丙酸 IX(NMM)與G-四鏈體結(jié)構(gòu)結(jié)合后其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)這一現(xiàn)象，設(shè)計了一種簡單的無標(biāo)記熒光檢測法用于檢測卡那霉素，試驗原理如圖2(b)所示。其設(shè)計了P1與P2兩條單鏈DNA，P1末端包含一個G-四鏈體DNA序列，P1中段與P2互補(bǔ)，P2為卡那霉素的DNA適配體。當(dāng)卡那霉素不存在時，P1與P2相互雜交，P1無法形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，添加NMM后，熒光強(qiáng)度不會增強(qiáng)。當(dāng)卡那霉素存在時，其與P2結(jié)合，導(dǎo)致P1釋放，加入NMM后，P1與NMM結(jié)合自折疊形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，此時熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。該方法選擇性與靈敏度較好，線型范圍為0.5～100.0 nmol/L，檢測限為0.5 nmol/L，并且無需熒光基團(tuán)的修飾，操作簡便。Zhou等[27]將適配體與發(fā)夾模版部分雜交，當(dāng)卡那霉素存在時，適配體脫離發(fā)夾模版并啟動Mg2+依賴性DNA酶的自主合成，合成的DNA酶切割信號發(fā)夾底物，釋放出可以與熒光染料硫黃素T(ThT)結(jié)合的G-四鏈體使熒光顯著增強(qiáng)，利用熒光強(qiáng)度的變化可對卡那霉素含量進(jìn)行測定。基于引物交換反應(yīng)(PER)，該熒光非標(biāo)記方法具有無標(biāo)簽、高靈敏度等優(yōu)點，在1～500 nmol/L內(nèi)線性關(guān)系良好(R2=0.994 1)，檢測限達(dá)0.36 nmol/L。

熒光法靈敏穩(wěn)定、檢測設(shè)備簡單，可以定量檢測動物性食品中卡那霉素殘留，但其使用需依賴物質(zhì)特定的熒光結(jié)構(gòu)。熒光法中標(biāo)記型探針標(biāo)記復(fù)雜且不同批次探針間可能有差異；非標(biāo)記型熒光法雖然無需標(biāo)記，但靈敏度不如前者，因而在檢測中常利用PER等信號放大手段有效提高檢測效率[27]，但同時也對試驗條件有更嚴(yán)格的要求。

圖2 基于卡那霉素適配體的熒光法檢測卡那霉素Figure 2 Determination of the aptasensor for detection of kanamycin based on fluorescent methods

2.3 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法是根據(jù)待測物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)，將化學(xué)量轉(zhuǎn)化為電學(xué)量而進(jìn)行定量分析的一種檢測方法，具有簡單快速、檢測靈敏等特點[45]。電化學(xué)傳感器主要由敏感分子識別元件和轉(zhuǎn)換器組成，敏感分子識別元件可與目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生作用，轉(zhuǎn)換器則負(fù)責(zé)輸出檢測信號。轉(zhuǎn)換器包含修飾層與電學(xué)系統(tǒng)兩部分，其中修飾層起到了將適配體與電極基底連接的作用，電學(xué)系統(tǒng)則將化學(xué)量放大轉(zhuǎn)換為電學(xué)量并顯示出來[46]。由傳感器設(shè)備輸出參數(shù)的不同，可將電化學(xué)分析法分為電化學(xué)阻抗譜和伏安法[41]。

2.3.1 電化學(xué)阻抗譜 電化學(xué)阻抗譜(EIS)是通過測量阻抗隨正弦波頻率的變化來對卡那霉素進(jìn)行測定的方法，其特異性與靈敏度良好、檢測速度快且無需標(biāo)記。如何高效率地將適配體結(jié)合在電極上是EIS面臨的關(guān)鍵問題之一，Kulikova等[28]在適配體傳感器表面層引入炭黑(CB)，利用CB、殼聚糖、硫雜杯芳烴復(fù)合物作為載體來固定適配體，這種表面層結(jié)構(gòu)使適配體傳感器對被測樣品的基質(zhì)化合物敏感性降低，該方法的線型范圍為0.7～50.0 nmol/L，檢測限為0.3 nmol/L，檢測牛奶和酸奶時，回收率為95%～115%。Sharma等[29]利用被修飾過的印刷碳電極(4-CP/SPCE)固定卡那霉素單鏈DNA適配體，再通過EIS進(jìn)行定量分析。這種固定形式極大提高了反應(yīng)平臺的穩(wěn)定性和靈敏度，該方法的線性范圍為1.20～600.00 ng/mL，檢測限為0.11 ng/mL，并且在結(jié)構(gòu)類似物鏈霉素(SRT)和慶大霉素(GENTA)存在時仍具有良好的選擇性，其無需標(biāo)記與可直接檢測的優(yōu)勢為現(xiàn)場檢測動物性食品中卡那霉素的殘留提出了一種新方案。

2.3.2 伏安法 伏安法是以電流變化作為輸出信號來對卡那霉素進(jìn)行測定。由于這類方法可以有效消除背景電流、獲得良好的靈敏度與較低的檢測限，因而被廣泛使用。Yao等[30]合成了包含胺基功能化的金屬有機(jī)框架(UiO-66-NH2)、多壁碳納米管@還原氧化石墨烯納米帶(MWCNT@rGONR)，利用三聚氰胺和三聚氰胺單體縮聚(MCA表示)合成的共價有機(jī)框架。并將UiO-66-NH2/MCA/MWCNT@rGONR納米復(fù)合材料作為電極，使用方波伏安法(SWV)檢測了牛奶和魚肉中的卡那霉素殘留。首先將適配體互補(bǔ)DNA(cDNA)固定于納米復(fù)合材料電極表面，當(dāng)卡那霉素不存在時，適配體與電極表面的cDNA互補(bǔ)配對，亞甲藍(lán)(MB)被插入到適配體與其互補(bǔ)鏈形成的雙鏈結(jié)構(gòu)中以產(chǎn)生電流信號；添加卡那霉素后，適配體與卡那霉素特異性結(jié)合，這時雙鏈DNA中的MB被釋放導(dǎo)致電流減少，根據(jù)電流變化即可對卡那霉素進(jìn)行定量分析。該方法穩(wěn)定、靈敏、選擇性較高，線性范圍為25～900 nmol/L，檢測限為13 nmol/L。為實現(xiàn)卡那霉素的超靈敏檢測，許多信號放大策略應(yīng)運(yùn)而生，常用的信號放大策略有雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)、催化發(fā)夾結(jié)構(gòu)自組裝(CHA)以及各種工具酶等。Tian等[31]將二硫化釩/納米金(VS2/AuNPs)納米復(fù)合材料作為電極表面支撐材料，利用差動伏安法(DPV)進(jìn)行檢測，并通過合理設(shè)計信號放大策略使檢測限大大降低，其中亞甲藍(lán)標(biāo)記的與適配體互補(bǔ)雜交的發(fā)夾DNA(MB-hDNA)和鈷鐵氧體(CoFe2O4)納米酶具有很好的信號放大作用。該傳感器檢測限低至0.5 pmol/L，線性范圍為0.001～1 000.000 nmol/L，用于牛奶樣品的回收率為91.24%～112.59%，相對標(biāo)準(zhǔn)差低于5.26%。此外這兩種檢測方法都具有可以通過改變適配體而對不同抗生素進(jìn)行檢測的優(yōu)點。

2.3.3 電化學(xué)發(fā)光法 將電化學(xué)分析法與化學(xué)發(fā)光法的優(yōu)勢相結(jié)合的電化學(xué)發(fā)光法(ECL)，由于具有發(fā)光反應(yīng)易控制、選擇性與靈敏性好的優(yōu)點而被用于食品檢測中[47]。Cheng等[32]設(shè)計了利用納米銀粒子(AgNPs)催化魯米諾—過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系以提高檢測靈敏度的適配體傳感器，AgNPs與魯米諾和適配體以銀—氨鍵結(jié)合，使得ECL的穩(wěn)定性和敏感性增強(qiáng)，再根據(jù)ECL的強(qiáng)度即可確定卡那霉素濃度。該傳感器準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性好，線性范圍為0.5～100.0 ng/mL，檢測限為0.06 ng/mL，并且同樣可以通過改變適配體而用于不同目標(biāo)物質(zhì)的檢測。這種將多種方法結(jié)合應(yīng)用以提高效率的檢測方法，為食品檢測提供了新方向。

與其他檢測方法相比，電化學(xué)分析法檢測成本低、反應(yīng)速度快，并且具有易微型化、易實現(xiàn)在線監(jiān)測的突出優(yōu)勢，因此在現(xiàn)場快速檢測中具有其他方法難以實現(xiàn)的應(yīng)用潛力[46]。但是基于電化學(xué)分析法的檢測方法仍面臨許多問題，如何固定適配體以提高檢測效率、如何避免非特異性吸附、如何設(shè)計制造簡便且成本低廉的電極材料以實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，這些問題都使電化學(xué)分析方法在基質(zhì)復(fù)雜的食品檢測中的使用受限[48]。

2.4 表面增強(qiáng)拉曼散射法

表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的檢測原理為將待測物分子吸附于粗糙納米金屬材料表面，使待測物的拉曼信號增強(qiáng)104～107倍，因其靈敏、簡便、響應(yīng)快、無需進(jìn)行復(fù)雜的樣品預(yù)處理等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品檢測領(lǐng)域。其同樣可以有效檢測動物性食品中卡那霉素殘留。隨著激光及納米技術(shù)的快速發(fā)展，SERS的靈敏度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性都獲得了很大提升。

SERS檢測法獲得信號的質(zhì)量與活性基底的選擇關(guān)系密切，Jiang等[33]以結(jié)合了AgNPs與AuNPs各自的性能優(yōu)點的復(fù)合金@銀核殼(Au@Ag)結(jié)構(gòu)作為活性基底，利用SERS原理實現(xiàn)了卡那霉素的超靈敏檢測，其試驗原理如圖3所示。將探針DNA結(jié)合到AuNPs表面，包裹銀殼后添加被熒光染料Cy3標(biāo)記的適配體，此時被標(biāo)記的適配體與探針DNA堿基互補(bǔ)配對。當(dāng)加入卡那霉素后，這種互補(bǔ)配對發(fā)生解離，此時Cy3遠(yuǎn)離銀殼導(dǎo)致SERS信號減弱。這種方法線性范圍為10-7～10-11g/mL，檢測限低至0.90 pg/mL，在牛奶樣品中回收率達(dá)90.4%～112.0%，并且總試驗時間低于1 h。田潤[49]將DNA滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)與SERS聯(lián)用，開發(fā)了一種簡便、靈敏檢測卡那霉素的適配體傳感器。核酸適配體被組裝到磁珠上，并與其互補(bǔ)鏈雜交形成生物探針。當(dāng)卡那霉素存在時，互補(bǔ)鏈被釋放并利用RCA技術(shù)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)捕獲封閉磁珠和無標(biāo)記封閉Au@Au核殼，經(jīng)磁分離得到磁珠—核殼—擴(kuò)增產(chǎn)物復(fù)合物用于檢測SERS信號。隨著卡那霉素濃度的增加，傳感器信號隨之增長，線型相關(guān)系數(shù)R2為0.994 8，檢出限達(dá)0.867 pg/mL，樣品回收率為96%～118%。該適配體傳感器中無需對金@金核殼(Au@Au)進(jìn)行標(biāo)記，且制備出的Au@Au核殼穩(wěn)定性好，信號持久，可用于即時檢測。

圖3 基于復(fù)合金@銀核殼的SERS法檢測卡那霉素原理示意圖[33]Figure 3 Schematic diagram of the SERS-based method for kanamycin detection by using double strand DNA aptamer-bonding Au@Ag NP

SERS檢測法靈敏快速且無需樣品預(yù)處理，但在基于SERS檢測法快速發(fā)展的同時，也逐漸發(fā)現(xiàn)性能好的活性基底較難獲得、復(fù)雜的食品基質(zhì)對分析結(jié)果影響較大等問題，且目前基于SERS分析方法的評價標(biāo)準(zhǔn)尚未明確[50]，仍需不斷探索以發(fā)現(xiàn)最優(yōu)檢測方案。

2.5 側(cè)流層析試紙條法

開發(fā)可用于現(xiàn)場檢測的方法對食品市場監(jiān)管具有重要意義，層析試紙條法可直接利用肉眼觀察、成本低、操作簡便、無需專業(yè)培養(yǎng)即可進(jìn)行測定。Liu等[34]設(shè)計了一種可用于現(xiàn)場快速檢測的側(cè)流層析試紙條，其以適配體修飾的AuNPs作為探針。當(dāng)未加入卡那霉素時，T區(qū)與C區(qū)都顯示明顯紅色，隨著卡那霉素濃度變大，C區(qū)顏色基本不變而T區(qū)紅色逐漸變淺，濃度為35 nmol/L時顏色完全消失。這種側(cè)流層析試紙條法檢出限為0.077 8 nmol/L，可以在10 min內(nèi)完成檢測，通過肉眼觀察顏色變化可進(jìn)行定性分析，利用掃描器可在1～30 nmol/L 內(nèi)進(jìn)行定量分析。雖然該側(cè)流層析試紙條具有低成本、快速簡便等優(yōu)點，但是其檢測限較高，且復(fù)雜的食品基質(zhì)和樣品前處理都會對檢測結(jié)果造成干擾。

3 總結(jié)與展望

隨著人們生活水平的提高，食品安全問題逐漸走入公眾視野并受到了極大的重視?？股卦趧游镄允称分械臍埩艚o食品安全造成了極大的威脅，因此對其進(jìn)行檢測具有十分重要的意義。卡那霉素被廣泛用于治療動物疾病，在畜禽養(yǎng)殖中濫用會導(dǎo)致其在動物性食品中殘留超標(biāo)。檢測中常將核酸適配體與納米材料如AuNPs、PtNPs、層狀WS2納米片等結(jié)合使用，使得檢測方法靈活多樣、檢測能力不斷提高，總而言之檢測動物性食品中卡那霉素殘留的方法將不斷向著方便、快速、靈敏的方向發(fā)展。核酸適配體作為一種性能優(yōu)良的抗體替代識別探針，其前景廣闊，但仍面臨許多挑戰(zhàn)，如復(fù)雜食品基質(zhì)中的有些物質(zhì)會干擾適配體的特異性識別，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確[51]。因此發(fā)展特異性強(qiáng)、方便快速的檢測方法，并將適配體檢測方法與各種信號放大手段相結(jié)合，通過合理構(gòu)建信號放大策略可以極大提高檢測靈敏度，以實現(xiàn)卡那霉素殘留的超靈敏檢測。目前可用于檢測卡那霉素的核酸適配體種類較少，使其在食品檢測中的使用受限，后續(xù)研究可篩選出更多高質(zhì)量的適配體。同時，在構(gòu)建核酸適配體檢測卡那霉素時，需要驗證核酸適配體是否能與卡那霉素特異性結(jié)合，這是建立檢測方法的基礎(chǔ)[35]。