孫嘉笛， 高 璐， 張銀志， 孫秀蘭

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122）

單端孢霉烯族毒素（trichothecenes）是自然界中廣泛分布的一類真菌毒素， 由多種霉菌屬產(chǎn)生，主要包括鐮刀菌屬 （Fusarium）、 單端孢屬（Trichothecium）、頭孢霉（Cephalosporium）等[1]。 單端孢霉烯族毒素在多種谷類作物如大麥、小麥、燕麥、玉米、馬鈴薯[2-3]，以及肉、蛋、奶，甚至動(dòng)物飼料中都能被檢測(cè)到[4-5]。 T-2 毒素是由鐮刀菌屬代謝產(chǎn)生的一種A 型單端孢霉烯族毒素，是毒性最強(qiáng)的真菌毒素之一[6]。1973 年，世界衛(wèi)生組織將T-2 毒素歸類為農(nóng)產(chǎn)品、人類食品和動(dòng)物飼料中不可避免的污染物[7]。

T-2 毒素對(duì)人體健康和畜牧業(yè)有害， 其通常在儲(chǔ)存條件氣候寒冷或潮濕的谷物中被發(fā)現(xiàn)，特別是在燕麥、大麥、小麥和動(dòng)物飼料中[8-10]。T-2 毒素的毒性強(qiáng)、污染范圍廣、檢出水平高。根據(jù)Biomin 對(duì)全球飼料中真菌毒素含量進(jìn)行的調(diào)查，有19%的樣品被T-2 毒素污染，我國(guó)飼料樣品中T-2 毒素的污染率為79.5%， 這些樣品中T-2 毒素的水平最高可達(dá)735 ng/g[11]。 大骨節(jié)病（kashin-beck disease，KBD）流行地區(qū)（如青海省和四川省）的飲用水以及中藥中也檢測(cè)到T-2 毒素[12]。此外，雖然大骨節(jié)病的病因尚不清楚，但有理由懷疑T-2 毒素是導(dǎo)致該病癥的主要因素之一， 在KBD 流行的地區(qū)，T-2 毒素的含量相對(duì)較高，小麥污染的平均水平為78.91 μg/kg，面粉污染的平均水平為47.47 μg/kg[4，13-14]。

T-2 毒素的毒性包括神經(jīng)毒性[15]、肝毒性[16]、生殖毒性[17]和腸毒性[18]。 目前，對(duì)于T-2 毒素毒性的評(píng)價(jià)方法主要有兩種，一種是動(dòng)物染毒實(shí)驗(yàn)（體內(nèi)評(píng)價(jià)），另一種是細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)（體外評(píng)價(jià)）。 基于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體外評(píng)價(jià)模型已見報(bào)道，然而該方法操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。 傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)大多是通過測(cè)定細(xì)胞常規(guī)的生理生化指標(biāo)來進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，然而該方法取得的結(jié)果特異性差，不夠直觀。 因此，亟需開發(fā)一種可以直接觀察、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、能真實(shí)篩查T-2 毒素細(xì)胞毒性的方法。

作者建立了一種可視化的熒光細(xì)胞傳感器并對(duì)T-2 毒素的細(xì)胞毒性進(jìn)行篩查。利用T-2 毒素毒性通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)應(yīng)答元件TRE 與mCherry 的啟動(dòng)子構(gòu)建獨(dú)立的質(zhì)粒， 通過轉(zhuǎn)染將其導(dǎo)入HEK293 細(xì)胞， 成功建立了能穩(wěn)定表達(dá)熒光的細(xì)胞株，當(dāng)T-2 毒素及其代謝產(chǎn)物刺激細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)特異性受體及其信號(hào)通路被激活，應(yīng)答元件TRE 通過信號(hào)通路啟動(dòng)所連接的熒光蛋白表達(dá)，可直接示蹤細(xì)胞內(nèi)部變化過程。 使用該熒光細(xì)胞篩查T-2 毒素的毒性，采用倒置熒光顯微鏡和寬場(chǎng)高內(nèi)涵成像儀觀察和記錄細(xì)胞受到T-2 毒素刺激后的熒光變化， 建立毒素質(zhì)量濃度與細(xì)胞熒光強(qiáng)度的劑量-效應(yīng)關(guān)系，完成對(duì)T-2 毒素的實(shí)時(shí)、精確、定量篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

T-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)品、HT-2 毒素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma 化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；Lipofectamine 3000（Invitrogen，CA）：美國(guó)Thermo fisher 公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒：TIANGEN 生物科技公司產(chǎn)品；LB 培養(yǎng)基、瓊脂粉：國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品；氨芐霉素、G418 抗生素：Aladdin 公司產(chǎn)品。

1.2 材料與設(shè)備

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)基的配制：人胚腎HEK293 細(xì)胞完全培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液（均為體積分?jǐn)?shù)）。 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)：將細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持95%濕度以及體積分?jǐn)?shù)5%的CO2。 HEK293 細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，2 d 更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，除去培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基。 加入PBS 溶液清洗3 次，以清洗殘留的培養(yǎng)基，之后加入1 mL 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25% EDTA 的胰酶消化液，在培養(yǎng)箱中孵育2～3 min，立即加入1 mL 的完全培養(yǎng)基終止消化。 收集細(xì)胞至無菌離心管中，800 r/min 離心5 min，棄去培養(yǎng)液，按照1∶3 的傳代比例加入相應(yīng)的完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。 選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 pcDNA3.1-TRE-mCherry 熒光質(zhì)粒的構(gòu)建載體pcDNATM 3.1 （+） 包含一個(gè)多克隆位點(diǎn)（multiple cloning site，MCS）。 將TRE （5′-TGAC/GTCA-3′） 改造為8 串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)（5′-TGACTCATGACTCATGACTCATGACTCATGACTCA TGACTCATGACTCATGAC-3′）[19-20]， 將獲得的串聯(lián)序列與mCherry 的啟動(dòng)子連接以獲得目標(biāo)基因序列，將設(shè)計(jì)的靶基因序列插入pcDNA3.1 的MCS 中以構(gòu)建重組DNA，酶切位點(diǎn)為Sac I-Xho I。 AmpR設(shè)計(jì)用于篩選原核生物抗性，NeoR 設(shè)計(jì)用于篩選真核生物抗性。

氨芐霉素用于篩選原核表達(dá)。 配置固態(tài)和液態(tài)LB 培養(yǎng)基，高壓滅菌冷卻至50～60 ℃時(shí)，加入氨芐霉素用于抗性篩選， 得到含50 μg/mL 氨芐霉素的LB 培養(yǎng)基。 無菌狀態(tài)下，挑取TRE-mCherry 感受態(tài)菌種（菌種由天津卡酶德公司構(gòu)建）劃線，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。 挑取單克隆菌落，接入上述培養(yǎng)基，搖床37 ℃過夜培養(yǎng)。 依據(jù)EndoFree 質(zhì)粒抽提手冊(cè)，提取大量重組DNA，保存于－20 ℃，避免反復(fù)凍融。

1.3.3 熒光質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞鋪板于6 孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的主要試劑是陽離子脂質(zhì)體3000，根據(jù)說明書進(jìn)行操作。 以6 孔板為例，取兩支滅菌離心管，一管中加入125 μL 無血清培養(yǎng)基、2.5 μg TRE 標(biāo)記的DNA 質(zhì)粒和5 μL P3000 試劑， 另外一管中加入7.5 μL Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑， 室溫下靜置5 min后，將第二管中混合試劑加入第一管中，輕輕混勻，室溫靜置15 min， 將得到的DNA-脂質(zhì)復(fù)合物均勻滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板中， 混勻后放回到培養(yǎng)箱中2～4 d，傳代培養(yǎng)并使用新霉素進(jìn)行真核篩選，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞分析[21-22]。

1.3.4 HEK293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性分析T-2毒素質(zhì)量濃度為：0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL，計(jì)算增殖抑制率，根據(jù)抑制率分析HEK293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后增殖活性。

式中：Y 為細(xì)胞增殖抑制率，%；A0為空白組吸光度；A1為對(duì)照組吸光度；A2為轉(zhuǎn)染組吸光度；A3為無毒素添加轉(zhuǎn)染組吸光度。

1.3.5 轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞活性氧檢測(cè)多功能熒光酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光相對(duì)強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度值分析HEK293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后活性氧含量。

人教版初中語文教材九年級(jí)上冊(cè)第四單元是“小說”單元，從“文體”角度彰顯九年級(jí)新教材組元的結(jié)構(gòu)特征。入選課文有魯迅的《故鄉(xiāng)》、莫泊桑的《我的叔叔于勒》和曹文軒的《孤獨(dú)之旅》。其中，《故鄉(xiāng)》《我的叔叔于勒》是“教讀課文”，《孤獨(dú)之旅》是“自讀課文”，三篇文章都是從“成長(zhǎng)小說”方面來推進(jìn)的。下文中，筆者以“自讀課文”《孤獨(dú)之旅》的課堂操作為例，探討在小說的課堂教學(xué)中培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立閱讀能力的有效途徑。

1.3.6 轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞凋亡檢測(cè)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用Cell Quest 軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.7 熒光HEK293 細(xì)胞傳感器篩查T-2 毒素的毒性基于T-2 毒素的細(xì)胞毒性通路作用， 通過HEK293 細(xì)胞熒光傳感器所表達(dá)的熒光強(qiáng)度對(duì)T-2毒素進(jìn)行毒性篩查。 經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)的HEK293 細(xì)胞收集后接種于無菌96 孔板中，培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，加入100 μL 含有10 ng/mL T-2 毒素的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置不含毒素的對(duì)照組以及未進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的空白組。 處理完成后立即置于酒精擦拭過的寬場(chǎng)高內(nèi)涵成像儀中， 連續(xù)進(jìn)行12 h 實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)mCherry 表達(dá)，每1 h 進(jìn)行細(xì)胞熒光成像拍攝及熒光強(qiáng)度檢測(cè)， 分析得到關(guān)于時(shí)間響應(yīng)的T-2 毒素毒性。

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞收集， 接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，加入100 μL 含不同質(zhì)量濃度的T-2 毒素的培養(yǎng)液，分別為：0.5、1、2、5、10、15、20、25、30 ng/mL。 適宜時(shí)間后對(duì)mCherry 表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)， 在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光成像拍攝，并通過多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。 根據(jù)熒光強(qiáng)度值與T-2 毒素關(guān)系進(jìn)行線性擬合，計(jì)算檢測(cè)限（LOD）。

1.3.8 樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

用三氯甲烷-無水乙醇溶液 （體積比為4∶1）提取面粉樣品，使用中性氧化鋁/活性炭柱純化，然后制成樣品溶液[23]。 對(duì)處理后的面粉樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，T-2 毒素的終質(zhì)量濃度為0、2、5、10、20 ng/mL，對(duì)該溶液進(jìn)行無菌過濾并用于細(xì)胞熒光傳感分析。

1.3.9 熒光HEK293 細(xì)胞對(duì)T-2 毒素代謝產(chǎn)物的毒性篩查研究表明，真菌毒素的代謝產(chǎn)物與原毒素結(jié)構(gòu)相似，并且同樣有極高的毒性作用[24-25]。 T-2毒素是單端孢霉烯家族中毒性最強(qiáng)的一種。 T-2 毒素發(fā)生去乙?；蟠x成HT-2 毒素， 兩者的結(jié)構(gòu)十分相似，且在體內(nèi)主要以HT-2 形式存在[26]。 為了對(duì)T-2 毒素的代謝衍生物進(jìn)行毒性檢測(cè)，利用不同質(zhì)量濃度的HT-2 毒素（0.2、0.5、1、5、10、20、30、40、50 ng/mL） 與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞孵育8 h，拍攝細(xì)胞熒光成像，監(jiān)測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 HEK293 細(xì)胞熒光傳感器原理

mCherry 是常用的示蹤劑之一， 其顏色和單體分子的光穩(wěn)定性優(yōu)于其他熒光蛋白標(biāo)記[27]。 HEK-293 細(xì)胞易于轉(zhuǎn)染， 是表達(dá)異源基因的常用細(xì)胞模型[28-29]。 研究發(fā)現(xiàn)，HEK293 細(xì)胞構(gòu)建的生物模型具有更好的熒光響應(yīng)， 因此將mCherry 和HEK293 細(xì)胞應(yīng)用于生物模型的構(gòu)建。

由圖1 所示， 在生物模型的構(gòu)建中，以pcDNA3.1 為質(zhì)粒載體，mCherry 的啟動(dòng)子序列與AP-1 識(shí)別元件TRE 相連，TRE 相當(dāng)于級(jí)聯(lián)信號(hào)的“啟動(dòng)子”，mCherry 熒光蛋白報(bào)告基因作為模型中的輸出信號(hào)。 利用脂質(zhì)體可以和細(xì)胞膜融合的特點(diǎn)，將pcDNA3.1-TRE-mCherry 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)入HEK293細(xì)胞。當(dāng)T-2 毒素刺激細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)AP-1 信號(hào)因子，引起識(shí)別元件TRE 啟動(dòng)和熒光蛋白表達(dá)。

圖1 HEK293 細(xì)胞熒光傳感器工作原理Fig. 1 A schematic illustration of the working principle of a HEK293 cell sensor

2.2 pcDNA3.1-TRE-mCherry 熒光質(zhì)粒的構(gòu)建

如圖2（a）所示，通過克隆TRE 序列得到串聯(lián)序列， 以提升信號(hào)的響應(yīng)速度， 將串聯(lián)序列與mCherry 的啟動(dòng)子連接以獲得目標(biāo)基因序列TREmCherry， 將其插入空載質(zhì)粒pcDNA3.1 的MCS 多克隆位點(diǎn)中，從而構(gòu)建pcDNA3.1-TRE-mCherry 質(zhì)粒。如圖2（b）所示，最終獲得4 719 bp 的重組質(zhì)粒，證明了pcDNA3.1-TRE-mCherry 質(zhì)粒的成功構(gòu)建。

圖2 pcDNA3.1-TRE-mCherry 質(zhì)粒的構(gòu)建與酶切凝膠電泳圖Fig. 2 Construction of pcDNA3.1-TRE-mCherry plasmid and enzyme gel electrophoresis

2.3 熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.3.1 熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響將轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞置于光學(xué)顯微鏡中拍照觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖3（a）所示，對(duì)照組與轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞生長(zhǎng)狀況正常，細(xì)胞形狀完整，從形態(tài)上可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。

為確保轉(zhuǎn)染后的HEK293 細(xì)胞能維持正常的細(xì)胞活性， 用CCK-8 法對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測(cè)。 如圖3（b）所示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TRE-mCherry質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相對(duì)活性97.87%，與對(duì)照組細(xì)胞相對(duì)活性基本一致。 不同質(zhì)量濃度T-2 毒素刺激細(xì)胞后， 轉(zhuǎn)染前后HEK293 細(xì)胞增殖抑制率大致相同，見表1。 說明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活性基本保持不變，未對(duì)細(xì)胞的正常生理生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響。

表1 T-2 毒素暴露對(duì)轉(zhuǎn)染前后HEK293 細(xì)胞增殖抑制率的影響Table 1 Effects of T-2 toxin exposure on proliferation inhibition rate of HEK293 cells before and after transfection

圖3 HEK293 細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果圖及其轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活性Fig. 3 Effect of plasmid transfection on HEK293 cells and its effect on cell activity after transfection

2.3.2 熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞活性氧水平的影響通過熒光相對(duì)強(qiáng)度變化可反映活性氧含量變化，HEK293 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后熒光相對(duì)強(qiáng)度見圖4。 與對(duì)照組相比， 轉(zhuǎn)染組的熒光相對(duì)強(qiáng)度并沒有顯著變化，此外，轉(zhuǎn)染前與轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光相對(duì)強(qiáng)度均與空白組相差1 倍以內(nèi)， 由此說明熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞沒有產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)， 未造成氧化應(yīng)激損傷，對(duì)細(xì)胞正常生理活性未造成影響。

圖4 熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞活性氧水平的影響Fig. 4 Effect of transfection on reactive oxygen species level detected by fluorescence

2.3.3 熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響通過細(xì)胞凋亡試劑盒測(cè)得轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡率，并通過流式細(xì)胞儀對(duì)早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。 由于HEK293 細(xì)胞自身貼壁不牢，極易從細(xì)胞皿上脫落，造成細(xì)胞自噬，因此，圖5 中對(duì)照組細(xì)胞凋亡率在17%左右， 但轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡無明顯差異，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡未產(chǎn)生不良影響。

圖5 轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞凋亡影響的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖Fig. 5 Flow cytometry analysis of the effect of transfection on apoptosis

綜合細(xì)胞活性、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平以及細(xì)胞凋亡結(jié)果，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TRE-mCherry 質(zhì)粒后的HEK293 細(xì)胞符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.3.4 HEK293 細(xì)胞熒光傳感器對(duì)T-2 毒素毒性篩查T-2 毒素刺激細(xì)胞后， 引起TNF 顯著上調(diào)，并激活MyD88、JNK 和p38 信號(hào)因子， 參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致AP-1 活化，在細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥等病理過程中起重要作用。 基于HEK293 細(xì)胞熒光傳感模型，進(jìn)行T-2 毒素毒性作用與時(shí)間響應(yīng)關(guān)系分析。 用10 ng/mL T-2 毒素刺激HEK293 細(xì)胞，在寬場(chǎng)高內(nèi)涵成像儀中進(jìn)行12 h 的實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)。如圖6（a）所示，轉(zhuǎn)染后的HEK293 細(xì)胞呈現(xiàn)熒光強(qiáng)度變化，說明該熒光傳感模型可以對(duì)T-2 毒素進(jìn)行毒性檢測(cè)。 HEK293 細(xì)胞熒光相對(duì)強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高， 在4 h 時(shí)開始出現(xiàn)紅色熒光，4 h 后熒光逐漸增強(qiáng)，8 h 時(shí)熒光接近最大值， 之后熒光值趨于穩(wěn)定，說明該熒光傳感模型對(duì)T-2 毒素毒性作用呈現(xiàn)時(shí)間響應(yīng)正相關(guān)（見圖6（b）），為接下來使用HEK293細(xì)胞熒光傳感模型進(jìn)行不同質(zhì)量濃度T-2 毒素和HT-2 毒素的毒性篩查提供支撐。

圖6 10 ng/mL T-2 毒素刺激HEK293 細(xì)胞后熒光強(qiáng)度變化Fig. 6 Fluorescence intensity changes of HEK293 cells stimulated by T-2 toxin of 10 ng/mL

基于HEK293 細(xì)胞熒光傳感模型，進(jìn)行T-2 毒素毒性作用與劑量響應(yīng)關(guān)系分析。 配制不同質(zhì)量濃度的T-2 毒素暴露于轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，T-2 毒素質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、15、20、25、30 ng/mL，8 h 后將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下，對(duì)細(xì)胞熒光表達(dá)和強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。 由圖7（a）可知，在T-2 毒素質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)僅有微弱的熒光，隨著T-2毒素質(zhì)量濃度的不斷升高，細(xì)胞呈現(xiàn)的熒光不斷增強(qiáng)；當(dāng)T-2 毒素質(zhì)量濃度達(dá)到25 ng/mL 時(shí)，熒光強(qiáng)度最大，且熒光值增長(zhǎng)速度隨著質(zhì)量濃度的增加而變緩慢。 此外，根據(jù)T-2 毒素質(zhì)量濃度-熒光相對(duì)強(qiáng)度曲線，計(jì)算得出T-2 毒素的EC50為16.27 ng/mL。將T-2 毒素的質(zhì)量濃度（1～25 ng/mL）與對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行線性擬合，得到線性方程：y=1.149 38x+64.72，R2=0.969，LOD 為0.691 ng/mL。

圖7 HEK293 熒光細(xì)胞傳感器對(duì)T-2 毒素的毒性篩查Fig. 7 Toxicity screening of T-2 toxin by HEK293 cellbased sensor

2.4 實(shí)際樣品實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)，將0、2、5、10、20 ng/mL的T-2 毒素添加到提取后的面粉樣品中，經(jīng)過無菌處理后用細(xì)胞熒光傳感器進(jìn)行毒素毒性篩查，結(jié)果見圖8。

圖8 樣品添加T-2 毒素刺激HEK293 細(xì)胞后的熒光成像圖Fig. 8 Fluorescence imaging of HEK293 cells stimulated by T-2 toxin

基于HEK293 細(xì)胞熒光傳感器，可通過測(cè)得的熒光相對(duì)強(qiáng)度對(duì)應(yīng)T-2 毒素質(zhì)量濃度。 樣品平均加標(biāo)回收率是86.13%～126.20%，見表2。 結(jié)果表明該方法具有較高的準(zhǔn)確性， 可用于實(shí)際樣品中的T-2毒素可視化篩查。

表2 樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)回收率Table 2 Result of recovery rate of spiked sample

2.5 HEK293 細(xì)胞熒光傳感器對(duì)T-2 毒素代謝產(chǎn)物毒性篩查

T-2 毒素代謝產(chǎn)物HT-2 毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化特性與T-2 毒素極為相似，僅有C-4 位置處的官能團(tuán)不同，推測(cè)可以使用HEK293 細(xì)胞熒光傳感模型進(jìn)行HT-2 毒素的毒性篩查。 分別用0.2、0.5、1、5、10、20、30、40、50 ng/mL 的HT-2 毒素刺激轉(zhuǎn)染后的HEK293 細(xì)胞，8 h 后將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下，對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 由圖9（a）所示，HT-2 毒素刺激后，細(xì)胞內(nèi)mCherry 表達(dá)，說明該熒光傳感模型可以進(jìn)行HT-2 毒素的毒性篩查。 隨著HT-2 毒素質(zhì)量濃度增加， 細(xì)胞內(nèi)熒光相對(duì)強(qiáng)度不斷升高，根據(jù)HT-2 毒素質(zhì)量濃度-熒光相對(duì)強(qiáng)度曲線， 計(jì)算得出HT-2 毒素的EC50為27.65 ng/mL，說明HT-2 毒素的細(xì)胞毒性小于T-2 毒素， 與之前相關(guān)報(bào)道基本一致[30-31]。

圖9 HEK293 細(xì)胞熒光傳感器對(duì)T-2 毒素代謝產(chǎn)物HT-2的毒性篩查Fig. 9 Toxicity screening of T-2 toxin metabolite HT-2by HEK293 cell-based fluorescence sensor

3 結(jié) 語

基于T-2 毒素的毒性特定信號(hào)通路，選取毒性關(guān)鍵靶點(diǎn)基因AP-1 識(shí)別元件TRE 以及mCherry，構(gòu)建原核表達(dá)載體質(zhì)粒pcDNA3.1-TRE-mCherry，建立細(xì)胞熒光傳感模型用于篩查T-2 毒素的毒性。T-2 毒素可以誘導(dǎo)HEK293 細(xì)胞傳感器的紅色熒光蛋白表達(dá)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示，8 h 時(shí)紅色熒光蛋白表達(dá)穩(wěn)定， 根據(jù)質(zhì)量濃度-熒光相對(duì)強(qiáng)度曲線得出T-2 毒素的EC50為16.27 ng/mL，T-2 毒素質(zhì)量濃度在1～25 ng/mL 進(jìn)行線性擬合，線性方程為y=1.149 38x+64.72，R2=0.969，LOD 為0.691 ng/mL。進(jìn)行實(shí)際樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)， 樣品平均加標(biāo)回收率是86.13%～126.20%。 由于T-2 毒素的代謝產(chǎn)物是HT-2 毒素，與T-2 毒素具有相同的毒性官能團(tuán)，因此，也對(duì)HT-2 毒素進(jìn)行了毒性篩查。 HT-2 毒素的EC50為27.65 ng/mL，與已有研究結(jié)論一致。 以上結(jié)果表明，該熒光細(xì)胞傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)T-2 毒素及其代謝產(chǎn)物毒性的準(zhǔn)確篩查，為食品中其他真菌毒素及其代謝產(chǎn)物安全、可靠的毒性篩查提供了新的手段和思路。