韓程程，夏凱，龔茹瑩，吳栩涵，張蕾，梁新樂

適于檢測(cè)非洲豬瘟病毒的點(diǎn)亮Spinach-p54 RNA適配體的設(shè)計(jì)及應(yīng)用

韓程程1,2，夏凱1,3，龔茹瑩1，吳栩涵1，張蕾1,2，梁新樂1,2

1. 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，杭州 310018 2. 浙江工商大學(xué)食品生物工程研究所，杭州 310018 3. 浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023

非洲豬瘟病毒(African swine fever virus， ASFV)是近年來流行的一種主要致病病毒，對(duì)我國的國民經(jīng)濟(jì)生活造成了嚴(yán)重影響。本研究以非洲豬瘟病毒的編碼保守蛋白基因序列片段為檢測(cè)目標(biāo)，結(jié)合點(diǎn)亮 Spinach RNA適配體的開關(guān)功能，設(shè)計(jì)了Spinach-p54的嵌合式RNA適配體。其特異地結(jié)合目標(biāo)序列并產(chǎn)生熒光，實(shí)現(xiàn)了在RNA水平上對(duì)非洲豬瘟病毒的快速檢測(cè)。研究結(jié)果表明，核酸適配體濃度200 nmol/L，反應(yīng)溫度為37 ℃，該方法檢出限為200 nmol/L，線性范圍為200～400 nmol/L。該方法特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，靈，可用于市場(chǎng)和養(yǎng)殖場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

核酸適配體；RNA；turn-on；非洲豬瘟

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種在家豬和野豬身上表現(xiàn)為急性出血熱癥狀的高傳染性的致命疾病[1～4]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties, OIE)將豬瘟列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病之一，我國將其列為一類動(dòng)物疫病[5]。我國從2018年遼寧省沈陽市首例非洲豬瘟疫情的確診至2020年共有32個(gè)省份報(bào)告了165起疫情，約119.3萬頭生豬被撲殺，極大地影響了生豬供應(yīng)，并給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的打擊[6]。ASFV病毒基因組為170～190 kb，基因易變異，病毒蛋白種類多、存活能力強(qiáng)、可通過多種方式和途徑進(jìn)行有效傳播，這是導(dǎo)致ASFV在染疫國家和地區(qū)常呈地方流行的重要原因之一[7]。因此對(duì)于ASFV的早期診斷以及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)對(duì)非洲豬瘟的防控顯得尤為重要。

目前，對(duì)于非洲豬瘟的檢測(cè)主要采取病原學(xué)檢測(cè)和血清學(xué)抗體檢測(cè)[8]。病原學(xué)檢測(cè)主要利用病毒分離培養(yǎng)、熒光抗體檢測(cè)和紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)鑒定方法。這些傳統(tǒng)鑒定方法盡管簡(jiǎn)單易行，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，并受人為因素干擾，不適宜現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。新發(fā)展的病毒核酸檢測(cè)主要有PCR、qRT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、等溫重組酶聚合酶擴(kuò)增結(jié)合側(cè)向流條法(isothermal recombinase polymerase amplification with lateral flow dipstick, RPA-LFD)等[5～9, 11]，此類方法檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高，但對(duì)操作環(huán)境要求高。血清學(xué)抗體檢測(cè)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析技術(shù)等[12～14]，這種基于抗原-抗體特異性結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)具有特異性強(qiáng)，易于觀察，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但制備抗體時(shí)間較久、成本較高，且不穩(wěn)定。近年來，由于核酸適配體與抗體相比具有成本低，穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，它被作為抗體分子的替代分子，受到諸多領(lǐng)域的關(guān)注。其中 Spinach是一種類似增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的核酸適配體[15]。該核酸適配體能夠與熒光染料3,5-二氟-4-羥基亞芐基咪唑啉酮(DFHBI)特異性結(jié)合產(chǎn)生1000倍的熒光強(qiáng)度，該染料無毒且具有良好的細(xì)胞通透性。Spinach已在RNA成像和小分子代謝物的傳感器等方面得到應(yīng)用[16-17]。除此之外，Spinach已被開發(fā)為報(bào)告核酶的自切割活性，并應(yīng)用于研究 RNA-RNA的體外組裝[18,19]。

本文以截短的 Spinach序列為基礎(chǔ)[20]，在其5′端和3′端分別聯(lián)接上基因的短序列，形成具有特異性識(shí)別基因序列RNA適配體— Spinach-p54，該適配體與基因互補(bǔ)配對(duì)后形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)能結(jié)合熒光團(tuán)DFHBI，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，從而完成快速定量檢測(cè)ASFV保守基因的特異性快速檢測(cè)(圖1)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

96孔板購自上海生工生物工程股份有限公司；酶標(biāo)儀購自美國BioteK公司；NanoPro超微量紫外可見分光光度計(jì)購自天津鼎昊源生物科技有限公司；超純水裝置系統(tǒng)Milli-Q購自美國Millipore公司。

圖1 點(diǎn)亮Spinach-p54 RNA適配體檢測(cè)非洲豬瘟示意圖

pUC-Spinach-p54-1/2/3質(zhì)粒，pUC-p54質(zhì)粒由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；HiScribe T7快速高效RNA合成試劑盒購自美國NEB公司；柱式RNA快速濃縮純化試劑盒，SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，硫酸卡那霉素，DEPC-treated Water購自上海生工生物工程股份有限公司；Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；DFHBI購自美國Sigma公司；KCl，MgCl2，NaH2PO4購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 Spinach-p54 RNA適配體設(shè)計(jì)

Spinach-p54 RNA適配體與ASFV的基因堿基互補(bǔ)配對(duì)的序列應(yīng)具有高度特異性，以防止不必要的分子內(nèi)或分子間雜交[21]。利用NUPACK (http://www.nupack.org/)對(duì)Spinach-p54 RNA適配體與RNA在等濃度條件下進(jìn)行建模，兩者結(jié)合后形成一個(gè)復(fù)合物的概率應(yīng)為 100%。基于上述原則對(duì)Spinach-p54 RNA適配體進(jìn)行篩選，共設(shè)計(jì)了在最小自由能條件下結(jié)合后形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)的3個(gè)Spinach-p54 RNA適配體(表1)。

1.3 Spinach-p54 RNA適配體及p54 RNA制備

將大腸桿菌() DH5α(分別含有pUC-Spinach-p54-1/2/3和 pUC-p54質(zhì)粒)接種于LB培養(yǎng)基(含硫酸卡那霉素，終濃度為50 μg/mL)于37 ℃，180 r/min的條件下培養(yǎng)12～16 h，利用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。將提取的pUC-Spinach-p54-1/2/3質(zhì)粒和pUC-p54質(zhì)粒分別利用Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶于37 ℃，酶切4 h。利用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化并利用NanoPro測(cè)定酶切產(chǎn)物濃度。利用T7快速高效RNA合成試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄體系為：酶切產(chǎn)物1 μg，NTP buffer Mix 10 μL，T7 RNA polymerase Mix 2 μL，用 DEPC-treated Water補(bǔ)齊至30 μL；轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 16 h。利用柱式RNA快速濃縮純化試劑盒對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化并利用NanoPro測(cè)定RNA濃度。RNA于–80 ℃保存，備用。

1.4 Spinach-p54 RNA適配體檢測(cè)反應(yīng)體系

將Spinach-p54 RNA適配體取出后進(jìn)行復(fù)性，條件為95 ℃變性5 min，靜置于冰上10 min[22]。在96孔板內(nèi)加入100 μL反應(yīng)體系，并于37 ℃避光反應(yīng)30 min，測(cè)量在37 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)460 nm，發(fā)射波長(zhǎng)502 nm下的熒光強(qiáng)度。反應(yīng)體系包括：30 μL緩沖液(140 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaH2PO4)，200 nmol/L RNA適配體(Spinach-p54- 1/2/3)，200 nmol/LRNA，1 μL 20 μmol/L DFHBI，最后用 DEPC- treated Water補(bǔ)齊至100 μL。其中設(shè)置陰性對(duì)照，陰性對(duì)照組中不存在RNA。

1.5 Spinach-p54-1 RNA適配體反應(yīng)溫度實(shí)驗(yàn)

按照1.4方法將反應(yīng)體系加入96孔板內(nèi)，分別于25 ℃、30 ℃、37 ℃避光反應(yīng)30 min，并分別檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6 Spinach-p54-1 RNA適配體檢測(cè)靈敏度實(shí)驗(yàn)

按照1.4方法中的條件添加緩沖液、Spinach- p54-1 RNA適配體和DFHBI，而RNA的濃度按20、100、200、300、400 nmol/L進(jìn)行添加，其中相應(yīng)濃度的拷貝數(shù)分別為11、55、110、165、220拷貝/μL，并用DEPC- treated Water補(bǔ)齊至100 μL。在37 ℃避光反應(yīng)30 min，37 ℃條件下檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

表1 適配體名稱和序列

1.7 Spinach-p54-1 RNA適配體檢測(cè)p54 RNA 的特異性實(shí)驗(yàn)

以大腸桿菌和李斯特菌()的總RNA模擬干擾信號(hào)，并加入到上述檢測(cè)體系中，考察Spinach-p54-1 RNA適配體檢測(cè)的特異性。

1.8 Spinach-p54-1 RNA適配體轉(zhuǎn)錄后直接檢測(cè)ASFV p54序列

將純化后的pUC-Spinach-p54-1酶切產(chǎn)物1 μg，NTP buffer Mix 10 μL，T7 RNA polymerase Mix 2 μL，用DEPC- treated Water補(bǔ)齊至30 μL，于37 ℃條件下轉(zhuǎn)錄16 h。轉(zhuǎn)錄結(jié)束后的Spinach-p54-1產(chǎn)物分別進(jìn)行下列操作(所有產(chǎn)物均未測(cè)定濃度)：(1)將轉(zhuǎn)錄體系于70 ℃加熱10 min對(duì)T7轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行失活，將失活后的樣品直接加入反應(yīng)體系中；(2)將轉(zhuǎn)錄體系直接加入到反應(yīng)體系中。Spinach-p54-1 RNA適配體按上述方法操作結(jié)束后加入96孔內(nèi)，再將方法1.4中的反應(yīng)體系加入96孔板中。在37 ℃避光反應(yīng)30 min，并于37 ℃條件下每隔1 min檢測(cè)熒光強(qiáng)度，共檢測(cè)45 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 Spinach-p54 RNA適配體建模及篩選

采用NUPACK設(shè)計(jì)并選擇了3種Spinach-p54 RNA適配體單個(gè)序列進(jìn)行建模。3種Spinach-p54 RNA適配體在37 ℃條件下所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2所示，它們最小自由能分別為–24.20 kcal/mol、–27.40 kcal/mol和–24.50 kcal/mol (表2)。當(dāng)Spinach-p54-1/2/3 RNA適配體與RNA在37 ℃結(jié)合后，最小自由能都顯著下降，分別為–52.88 kcal/mol、–51.38 kcal/mol和–46.28 kcal/mol。這表明單個(gè)適配體是不穩(wěn)定的，與RNA序列結(jié)合后增強(qiáng)了RNA適配體的穩(wěn)定性。Spinach-p54 RNA適配體與RNA濃度均為200 nmol/L時(shí)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加入DFHBI后均顯著地產(chǎn)生熒光，與對(duì)照組明顯區(qū)分(圖3)。這表明形成了可產(chǎn)生熒光的Spinach-p54 RNA適配體-RNA-DFHBI復(fù)合物，即Spinach-p54 RNA適配體可與RNA特異地結(jié)合。但是，由于本反應(yīng)體系中其他物質(zhì)的存在，實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較大的背景噪聲，需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2 點(diǎn)亮Spinach-p54 RNA適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)

表2 Spinach-p54 RNA適配體二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能

2.2 溫度顯著影響Spinach-p54 RNA適配體特異結(jié)合p54 RNA

溫度是影響化學(xué)反應(yīng)速度及 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)形成與穩(wěn)定的關(guān)鍵因素之一。在此首先考察了3種不同溫度對(duì)Spinach-p54 RNA適配體特異結(jié)合RNA的影響。在沒有RNA存在的情況下，單個(gè)RNA適配體的背景熒光定義為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，在探究的3種溫度下 Spinach-p54-1/2/3 RNA適配體與RNA濃度均為200 nmol/L的情況下均能產(chǎn)生明顯區(qū)分于陰性對(duì)照的熒光(圖3)。盡管在25 ℃條件下3個(gè)RNA適配體產(chǎn)生的熒光值與陰性對(duì)照未產(chǎn)生顯著性差異，但在30 ℃和37 ℃條件下3個(gè)RNA適配體產(chǎn)生的熒光值與陰性對(duì)照相比具有顯著性差異(<0.05)其中在37 ℃條件下產(chǎn)生的熒光值最強(qiáng)，表明Spinach-p54 RNA適配體-RNA-DFHBI復(fù)合物形成的最適溫度為37 ℃。盡管37 ℃為最適溫度，但因與RNA結(jié)合序列的不同，在該溫度下不同的RNA適配體產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度存在差異，其中Spinach-p54-1 RNA適配體產(chǎn)生的熒光值最大。表明Spinach-p54-1 RNA適配體為3個(gè)適配體中較為適合用于檢測(cè)ASFV的RNA適配體。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以Spinach-p54-1 RNA適配體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，除特殊說明外。

圖3 Spinach-p54 RNA適配體反應(yīng)溫度優(yōu)化

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)3種RNA適配體與RNA在不同溫度條件下形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了擬合計(jì)算。3種RNA適配體在3個(gè)不同溫度下共形成兩種不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)，故以Spinach-p54-1 RNA適配體為例繪制二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，其中25 ℃和30 ℃形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)相同。Spinach RNA適配體中與DFHBI

結(jié)合部分的結(jié)構(gòu)為G-quadruplex，G-quadruplex序列在Spinach-p54 RNA適配體的位置為G20、G23、G24、G25、G50、G53、G55、G57。其中G25(對(duì)應(yīng)于原始Spinach適配體G28位置)堿基堆積在四鏈體G24(對(duì)應(yīng)于原始Spinach適配體G27位置)上，并與DFHBI形成氫鍵[23,24]。在25 ℃和30 ℃條件下形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4A)其特征為存在5個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中 G25位于最大的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，該結(jié)構(gòu)由 12 個(gè)堿基構(gòu)成。在37 ℃條件下形成了包含4個(gè)莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4B)，其中G25位于由18個(gè)堿基構(gòu)成的最大莖環(huán)中。二級(jí)結(jié)構(gòu)圖結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明在37 ℃條件下形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)能更好的達(dá)到檢測(cè)ASFV的目的。

2.3 Spinach-p54-1 RNA適配體檢測(cè)范圍實(shí)驗(yàn)

靈敏度是檢驗(yàn)檢測(cè)方法可行性的一個(gè)主要參數(shù)，因此進(jìn)一步探究了Spinach-p54-1 RNA適配體對(duì)RNA最低檢測(cè)濃度。當(dāng)Spinach-p54-1 RNA適配體的濃度為200 nmol/L (110拷貝/μL)時(shí)，反應(yīng)強(qiáng)度在20～400 nmol/L (11～220拷貝/μL)RNA范圍內(nèi)隨著RNA濃度升高而升高，但濃度在20～100 nmol/L (11～55拷貝/μL)時(shí)產(chǎn)生的熒光值與陰性對(duì)照無法進(jìn)行明顯區(qū)分，當(dāng)濃度高于200 nmol/L (110拷貝/μL)時(shí)產(chǎn)生的熒光與陰性對(duì)照明顯區(qū)分(圖5A)。當(dāng)RNA濃度高于Spinach-p54-1 RNA適配體濃度時(shí)，產(chǎn)生的熒光值僅略微高于兩者濃度相等，表明當(dāng)Spinach-p54-1 RNA適配體與RNA濃度為1∶1時(shí)為產(chǎn)生熒光的最佳條件。當(dāng)Spinach-p54-1 RNA適配體濃度為400 nmol/L，RNA濃度范圍在200～400 nmol/L (110～220拷貝/μL)時(shí)熒光強(qiáng)度與RNA的濃度存在良好線性關(guān)系(圖5B)，校正曲線方程為=0.2059–3.4804，2=0.9863。

圖4 Spinach-p54 RNA適配體-p54 RNA復(fù)合物不同溫度下二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

圖5 Spinach-p54-1 RNA適配體檢測(cè)ASFV的靈敏度

2.4 Spinach-p54-1 RNA適配體識(shí)別特異性

為了評(píng)估篩選出的Spinach-p54-1 RNA適配體的特異性，利用大腸桿菌和李斯特菌的總RNA作為干擾信號(hào)。結(jié)果顯示，僅添加了大腸桿菌和李斯特菌總 RNA后產(chǎn)生的熒光值與陰性對(duì)照無法進(jìn)行有效區(qū)分，而在存在RNA的體系中再添加大腸桿菌和李斯特菌總RNA后產(chǎn)生的熒光值能明顯區(qū)分于陰性對(duì)照，且與僅有RNA存在的條件下產(chǎn)生的熒光值相似(圖6)。這表明Spinach-p54-1 RNA核酸適配體即使存在細(xì)菌RNA干擾仍對(duì)RNA具有較好的專一性。

圖6 Spinach-p54-1 RNA適配體檢測(cè)ASFV特異性

2.5 Spinach-p54-1 RNA適配體制備過程的簡(jiǎn)化

為提高 Spinach-p54-1 RNA適配體應(yīng)用性和經(jīng)濟(jì)性，本研究進(jìn)一步對(duì)Spinach-p54-1 RNA適配體制備過程進(jìn)行了簡(jiǎn)化，即在制備RNA適配體時(shí)刪除了試劑盒純化RNA的步驟，直接采用轉(zhuǎn)錄混合物。結(jié)果表明，對(duì)Spinach-p54-1 RNA適配體體外轉(zhuǎn)錄過程中的T7轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行失活處理后，發(fā)現(xiàn)其與RNA結(jié)合后產(chǎn)生的熒光值略高于陰性對(duì)照，但未產(chǎn)生明顯的區(qū)分(圖7)。對(duì)轉(zhuǎn)錄體系不做任何處理，直接應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的熒光能與陰性對(duì)照產(chǎn)生明顯區(qū)分，不過其產(chǎn)生的熒光隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，在30 min后其熒光值無法與陰性對(duì)照進(jìn)行區(qū)分。但其前30 min熒光能與陰性對(duì)照進(jìn)行明顯區(qū)分，表明該Spinach-p54-1 RNA適配體能夠在轉(zhuǎn)錄結(jié)束后直接應(yīng)用，可略過純化步驟，減少了實(shí)驗(yàn)流程，縮短了時(shí)間。

3 討論

RNA適配體是一種可形成發(fā)夾、莖環(huán)和 G-quadruplex等結(jié)構(gòu)并與靶分子特異性結(jié)合的RNA寡核苷酸序列，最初被應(yīng)用于檢測(cè) RNA水平上的基因表達(dá)和調(diào)控[22]。由于 RNA核酸適配體具有靈活性和方便性使其能夠作為新型報(bào)告基因應(yīng)用于體內(nèi)和體外成像、以及細(xì)菌、病毒的快速檢測(cè)領(lǐng)域[25～27]。本研究探索了RNA適配體用于非洲豬瘟病毒保守序列的快速檢測(cè)方法。

圖7 Spinach-p54-1 RNA適配體制備過程簡(jiǎn)化后對(duì)ASFV的診斷性能

本研究設(shè)計(jì)了3種特定 Spinach-p54 RNA適配體，每個(gè)適配體與RNA結(jié)合后產(chǎn)生的熒光能與陰性對(duì)照進(jìn)行明顯區(qū)分，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè) ASFV的目的。已有的研究表明溫度能夠影響適配體的折疊和熒光強(qiáng)度[28]，因此，通過探究不同溫度下Spinach- p54 RNA適配體的性能，發(fā)現(xiàn)3個(gè)適配體在37 ℃條件下形成的Spinach-p54 RNA適配體-RNA- DFHBI復(fù)合物所產(chǎn)生的熒光值均高于25 ℃和30 ℃，該結(jié)果與形成Spinach2-DFHBI-1T復(fù)合物的最佳溫度相同[29]。為了檢測(cè)Spinach-p54-1 RNA適配體的熒光分析效率，當(dāng)RNA濃度為200 nmol/L時(shí)即可檢測(cè)到明顯區(qū)分于陰性對(duì)照的熒光，整個(gè)檢測(cè)過程需要40 min。其中RNA為人工全合成，利用T7啟動(dòng)子體外轉(zhuǎn)錄獲得。而在真實(shí)臨床樣本中RNA濃度較低的情況下，可在前期通過磁珠富集[30～32]后進(jìn)行檢測(cè)，該部分需要今后的進(jìn)一步研究。

Zsak檢測(cè)是ASFV的高敏感、特異和快速的檢測(cè)技術(shù)。Wang等[33]開發(fā)了一種新的Zsak檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)方法能夠覆蓋98%已分離的菌株，且檢測(cè)限為6拷貝，具有很高的特異性。該方法在提取 DNA/RNA后還需要其他操作才能達(dá)到檢測(cè) ASFV的目的，而利用 Spinach-p54-1 RNA適配體可在提取RNA后直接進(jìn)行檢測(cè)。RPA-Cas12a方法中最低檢測(cè)DNA濃度為0.05 nmol/L，該檢測(cè)過程僅需 30～40 min[34]；除此以外Cas12a結(jié)合免疫層析條技術(shù)的最低檢測(cè)限為20個(gè)拷貝，該方法需要1 h才能完成檢測(cè)[35]，利用Cas12a檢測(cè) ASFV都需要對(duì)Cas12a蛋白進(jìn)行純化。本研究對(duì) Spinach-p54-1 RNA適配體制備過程進(jìn)行簡(jiǎn)化后，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄后無需純化，即能達(dá)到檢測(cè)ASFV的目的。以上結(jié)果表明，基于點(diǎn)亮Spinach-p54-1 RNA適配體的檢測(cè)方法具有較好的靈敏度、特異性和高效性。受限于生物安全法規(guī)對(duì)生物技術(shù)研究、開發(fā)與應(yīng)用安全的要求，本研究沒有使用臨床樣本驗(yàn)證該檢測(cè)方法的檢測(cè)效果，后續(xù)將在不同生物樣本中對(duì)該方法的檢測(cè)性能進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。

綜上所述，本研究設(shè)計(jì)了一種點(diǎn)亮 Spinach-p54 RNA適配體，可以用于快速檢測(cè) ASFV中的保守基因，通過檢測(cè)RNA產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度對(duì)ASFV進(jìn)行定量檢測(cè)。該方法處理時(shí)間短(僅為40 min)、靈敏度高、特異性強(qiáng)，為ASFV分子檢測(cè)手段提供了一種新的方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Design and application of lightening Spinach-p54 RNA apatmer to detect African swine fever virus

Chengcheng Han1,2, Kai Xia1,3, Ruying Gong1, Xuhan Wu1, Lei Zhang1,2, Xinle Liang1,2

African swine fever virus (ASFV) is a major and prevalent pathogenic virus in livestock. Its outbreak in the recent years has seriously affected the national economic life. In this study, a specific chimeric RNA aptamer Spinach-p54 corresponding to the conserved protein p54 of ASFV, was designed and used in assembling a toehold RNA module with a truncated lightening Spinach switch. They were used to detect thegene. The aptamer bound rapidly and paired specifically with the ASFVtarget sequence and produced fluorescence with the addition of DFHBI substrate. The results showed that the limit of detection was as low as 200 nmol/Lfragment, under the conditions of 200 nmol/L Spinach-p54 aptamer and 37 ℃, suggesting that the current method can provide a simple, specific, sensitive, and rapid on-site detection of ASFV at the RNA level in the markets and farms.

aptamer; RNA; turn-on; African swine fever viru

2021-09-21;

2021-11-30

韓程程，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。E-mail: 707884766@qq.com

張蕾，博士，講師，研究方向：分子免疫學(xué)。E-mail: zhanglei@zjsu.edu.cn

梁新樂，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)。E-mail: dbiot@mail.zjgsu.edu.cn

10.16288/j.yczz.21-335

2021/12/13 18:40:49

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20211210.1302.002.html

(責(zé)任編委: 盧大儒)