孫博，陳萍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春 130118）

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium，S.typhimurium）是一種全球性食源性致病菌，可引起腹瀉、傷寒、腹部絞痛、惡心、嘔吐等多種臨床癥狀，嚴(yán)重者可危及生命[1]。鼠傷寒沙門氏菌主要通過污染食品感染人類，其中牛奶是鼠傷寒沙門氏菌的主要感染源之一[2]。由鼠傷寒沙門氏菌引起的健康和安全事件頻繁被報(bào)道，對食品安全和公眾健康造成嚴(yán)重威脅[3]。因此，開發(fā)一種操作簡便、高效靈敏的鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法是食品安全監(jiān)測的一項(xiàng)緊迫任務(wù)。

常見的鼠傷寒沙門氏菌檢測方法主要有平板檢測法、儀器分析法、免疫學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)檢測方法等[4-5]。上述方法為現(xiàn)階段針對鼠傷寒沙門氏菌檢測的有效方法，但仍存在不足，為此針對鼠傷寒沙門氏菌更完善、更高效的檢測方法仍在持續(xù)研究中。

適配體是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選獲得的寡核苷酸，可以形成凸環(huán)、發(fā)夾、假節(jié)和G-四聚體等結(jié)構(gòu)[6-7]。對特定的金屬離子、有機(jī)物、蛋白質(zhì)或細(xì)胞等目標(biāo)分子具有高特異性和親和力[8]。與抗體相比，適配體具有可體外人工合成和修飾，純度高、親和力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、特異性高的特點(diǎn)[9-10]，近年來核酸適配體被廣泛應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測中[11-12]。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種核酸信號放大技術(shù)，通過單鏈DNA 引發(fā)兩個發(fā)夾探針生成雜交雙鏈，實(shí)現(xiàn)信號放大[13-15]。金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）是最常用的納米材料之一，由于獨(dú)特的光學(xué)性能和良好的生物相容性已廣泛應(yīng)用于比色檢測中[16]。近年來國內(nèi)外研究者對于核酸適配體技術(shù)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、金納米粒子三者構(gòu)成的檢測方法作出大量研究，例如：田潤等[17]以核酸適配體為引發(fā)劑，構(gòu)建基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的比色檢測方法用于檢測卡那霉素，檢測限低至0.9 nmol/mL；Wang 等[18]建立基于核酸適配體的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以AuNPs 為比色信號，用于檢測Hg+，檢測限為30 nmol/mL；Gao 等[19]應(yīng)用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)研制出5’-三磷酸腺苷的AuNPs 比色法適配體傳感器，檢測限達(dá)到10 nmol/mL。由此可知，這三種技術(shù)結(jié)合的方法檢測限低靈敏度高。本研究根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌核酸適配體設(shè)計(jì)引發(fā)序列以及兩個發(fā)夾探針，利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)前后鏈與AuNPs 之間的相互作用，構(gòu)建一種靈敏度高、操作成本低、高效的鼠傷寒沙門氏菌比色檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1800 紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)，上海力中科儀器有限公司；KYC-100B 空氣恒溫振蕩儀，CIMO 新苗儀器有限公司；DYY-11 型電泳儀，北京六一儀器廠；IQ350 凝膠成像系統(tǒng)，美國GE 公司。

氯金酸（AuCl3HCl·3H2O）、檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O）、氯化鈉（NaCl）、Ultra GelRed、TE Buffer（pH=8.0）、50×TAE Buffer（pH=8.5）均購買于北京鼎國藥業(yè)有限公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉均購買于長春市華益生物科技有限責(zé)任公司。本研究設(shè)計(jì)的寡核苷酸均購自庫美生物技術(shù)有限公司，并且通過高效液相色譜（HPLC）技術(shù)純化，寡核苷酸的序列如下：Salmonella typhimuriumaptamer（aptamer）[20]：5’-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATG ACA G-3’；Single-stranded DNA（ssDNA）：5’-CGG TGA CGC CGC CAT CCG-3’；Hairpin DNA1（Hp1）：5’-CGC CGC CAT CCG TGT TGT CGG ATG GCG GCG TCA CCG-3’；Hairpin DNA2（Hp2）：5’-ACA ACA CGG ATG GCG GCG CGG TGA CGC CGC CAT CCG-3’

1.2 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium，S.typhimurium）ATCC10376、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureussubsp.aureus，S.aureus）CICC21600、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）CICC21636、痢疾志賀氏菌（Shigella dysenteriae，S.dysenteriae）CICC23829、大腸埃希氏菌（Escherichiacoli，E.coli）CICC23657、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，S.thermophilus）CICC20174、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri，S.flexneri）CMCC51252 均來自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.3 AuNPs 的制備

參照文獻(xiàn)[19]采用氯金酸還原檸檬酸三鈉制備AuNPs。取0.01%的氯金酸溶液100 mL 于250 mL 錐形瓶中，在加熱磁力攪拌器上加熱至沸騰，然后迅速向沸騰的溶液中滴加1.0%檸檬酸鈉溶液4.0 mL；當(dāng)無色溶液逐漸變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)磁力攪拌加熱，保持沸騰狀態(tài)30 min 停止加熱。將得到的AuNPs 室溫下冷卻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 瓊脂糖凝膠電泳

將Hp1、Hp2 在95 ℃下加熱10 min 變性處理，然后室溫下冷卻1 h。取100 nmol/L的Hp1、100 nmol/L的Hp2、100 nmol/L 的Hp1 和100 nmol/L 的Hp2、100 nmol/L 的Hp1 和100 nmol/L 的Hp2 以及50 nmol/L的ssDNA，分別37 ℃震蕩孵育45 min。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后用1×TAE 緩沖液制備2%瓊脂糖凝膠，110 V 電泳40 min。

1.5 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時間的優(yōu)化

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是本實(shí)驗(yàn)采用的信號放大方法，所以雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的時間對檢測的靈敏度以及信號放大效率，起到重要作用。雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時間短，不利于雙鏈的形成，靈敏度低。因而我們對雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的時間進(jìn)行優(yōu)化，使檢測體系達(dá)到最佳狀態(tài)。在進(jìn)行檢測時，我們分別取時間：20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 min 分別進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)時間。反應(yīng)結(jié)束后加入AuNPs 室溫下孵育后，0.75 mol/L NaNO3作用下，靜置5 min，測定體系在400～800 nm 波長下吸光度。根據(jù)吸光度比值，確定雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的最佳反應(yīng)時間。

1.6 Hp1/Hp2與AuNPs 反應(yīng)時間

Hp1/Hp2與AuNPs 反應(yīng)達(dá)到動態(tài)平衡時間是比色體系的關(guān)鍵。我們采用10、20、30、40、50、60、70 min 不同時間進(jìn)行Hp1/Hp2與AuNPs 孵育反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將加入0.75 mol/L NaNO3溶液，靜置5 min，測定體系在400 nm～800 nm 波長下吸光度，根據(jù)吸光度比值選出最佳孵育時間。

1.7 Hp1/Hp2 的濃度

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中Hp1、Hp2 的濃度同樣會影響反應(yīng)的靈敏度，取Hp1/Hp2 濃度為60、70、80、90、100、110、120 nmol/L 分別進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，37 ℃孵育45 min；反應(yīng)結(jié)束后加入70 μL AuNPs 室溫下孵育50 min。最后加入0.75 mol/L NaNO3溶液，靜置5 min，測定體系在400 nm～800 nm 波長下吸光度，根據(jù)吸光度比值選出最適濃度。

1.8 基于核酸適配體和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比色方法建立

取不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌分別加入50 nmol/L aptamer，37 ℃恒溫孵育10 min，向溶液中加入濃度為50 nmol/L 的ssDNA，37 ℃恒溫震蕩30 min。加入100 nmol/L 的Hp1/Hp2 各10 μL 進(jìn)行雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，37 ℃孵育45 min；反應(yīng)結(jié)束后加入70 μL AuNPs室溫下孵育50 min。最后加入0.75 mol/L NaNO3溶液，靜置5 min，測定體系在400 nm～800 nm 波長下吸光度。

1.9 人工污染牛奶樣品檢測

從牛奶樣品中取檢樣25 g(mL)，加入225 mL 緩沖蛋白胨水于均質(zhì)袋內(nèi)進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)后于36±1 ℃培養(yǎng)12 h。分別取900 μL 樣品分別添加100 μL 鼠傷寒沙門氏菌（濃度為2.74×103、3.01×104、3.24×105、2.65×106、2.98×107CFU/mL），用基于核酸適配體結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系進(jìn)行檢測，結(jié)果與平板計(jì)數(shù)法對比，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Oringin 2018和IBS SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ANOVA 進(jìn)行方差分析，Duncan 進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 比色法原理

單鏈DNA 由于其暴露的含氮堿基帶有正電，通過分子之間靜電吸附在帶有負(fù)電的AuNPs 表面，單鏈DNA 可以保護(hù)AuNPs 在鹽誘導(dǎo)下不發(fā)生聚集。雙鏈DNA 和核酸適配體具有更高級的結(jié)構(gòu)，很難與AuNPs發(fā)生吸附作用。因此根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌特異性核酸適配體（aptamer）序列利用NUPACK 分析設(shè)計(jì)引發(fā)序列（ssDNA）和單鏈Hp1、Hp2。在鼠傷寒沙門氏菌存在下，aptamer與鼠傷寒沙門氏菌特異性結(jié)合后，在體系中加入ssDNA 引發(fā)Hp1、Hp2 打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，形成帶負(fù)電的雙螺旋長鏈DNA，與溶液中負(fù)電AuNPs 相互排斥。Hp1、Hp2 不再保護(hù)AuNPs，鹽的誘導(dǎo)作用下，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。當(dāng)溶液中不存在鼠傷寒沙門氏菌時，aptamer與ssDNA雜交，ssDNA 不在引發(fā)Hp1、Hp2 打開發(fā)夾發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因此Hp1、Hp2與帶負(fù)電的AuNPs 靜電吸附，在鹽作用下保護(hù)AuNPs 不發(fā)生聚集，顏色不發(fā)生變化?；谶m配體的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比色法檢測鼠傷寒沙門氏菌的原理如圖1 所示。

圖1 基于適配體的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比色法檢測鼠傷寒沙門氏菌的原理圖Fig.1 Schematic illustration of colorimetric assay for S.typhimurium detection based on aptamer and hybrid chain reaction

2.2 檸檬酸三鈉還原法制備AuNPs

由AuNPs 在400～800 nm 的紫外-可見光譜（圖2）可知：AuNPs 在約為525 nm 處有明顯的紫外吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)[21-23]中可知膠體金的最大吸收峰波長與平均粒徑具有良好的線性相關(guān)性，線性關(guān)系回歸方程為Y=0.4271X+514.56，其中X 為納米金平均粒徑、Y 為最大吸收峰波長。根據(jù)AuNPs 最大吸收峰波長525 nm計(jì)算得出平均粒徑為24.4 nm。

圖2 AuNPs 的紫外-可見光表征圖Fig.2 UV absorption spectrum of colloidal gold particles

2.3 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

瓊脂糖凝膠電泳用來驗(yàn)證雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中Hp1、Hp2 可以在ssDNA 引發(fā)下形成的雜交長螺旋。由圖3所示，泳道1 是分子量50～500 的Marker；泳道2 是100 nmol/L 的Hp1 和100 nmol/L 的Hp2 以及50 nmol/L 的ssDNA；泳道3 是100 nmol/L 的Hp1/Hp2；泳道4 和5 分別是100 nmol/L 的Hp2 和100 nmol/L的Hp1。由圖2 可知：只有Hp1/Hp2 存在時不發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，當(dāng)加入ssDNA 到Hp1 和Hp2 中，發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。由此說明ssDNA 可以成功引發(fā)Hp1、Hp2 發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

圖3 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)Fig.3 Gel electrophoresis experiment

2.4 基于核酸適配體雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系驗(yàn)證

為驗(yàn)證研究建立的比色方法將0 CFU/mL與107CFU/mL 濃度的鼠傷寒沙門氏菌加入體系中，經(jīng)過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后，在進(jìn)行納米金比色。由圖4 可知：當(dāng)不存在鼠傷寒沙門氏菌時，溶液顏色為紅色，在紫外可見吸收光譜中，525 nm 處形成特征峰；當(dāng)存在鼠傷寒沙門氏菌時，溶液顏色變?yōu)樗{(lán)色，在630 nm 處出現(xiàn)新的特征峰，并且在525 nm 處的特征峰下降。由此表明：鼠傷寒沙門氏菌可以使體系的顏色以及吸光度發(fā)生改變。

圖4 基于核酸適配體雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合納米金比色檢測鼠傷寒沙門氏菌Fig.4 Absorption spectra and photographs of AuNPs based on aptamer and hybrid chain reaction colorimetric in S.typhimurium

2.5 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時間的優(yōu)化

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)時間直接影響了體系的信號。如圖5 所示，A630/525 值隨著孵育時間的增長而增大，當(dāng)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時間達(dá)到45 min 后，A630/525值不在增加。說明雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時間在45 min 左右，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)幾乎達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)最佳反應(yīng)時間為45 min。

圖5 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時間優(yōu)化Fig.5 Optimization of HCR hybridization time

2.6 Hp1/Hp2與AuNPs 反應(yīng)時間

Hp1/Hp2與AuNPs 的結(jié)合時間對體系的信號也存在影響，如圖6 所示，A630/525 值隨著孵育時間的增長而增加，當(dāng)Hp1/Hp2與AuNPs 的結(jié)合時間達(dá)到50 min 后，A630/525 值不再增加。因此，Hp1/Hp2與AuNPs 最佳反應(yīng)時間為50 min。

圖6 Hp1/Hp2與AuNPs 反應(yīng)時間優(yōu)化Fig.6 Optimization ofHp1/Hp2-AuNPsincubation binding time

2.7 Hp1/Hp2 的濃度

Hp1/Hp2 是雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的重要組成部分，在AuNPs 聚集過程中起著至關(guān)重要的作用。如圖7 所示，A630/525 值隨著Hp1/Hp2 的濃度的增加而增大，但當(dāng)Hp1/Hp2 濃度大于100 nmol/L 時，體系的A630/525值最大。當(dāng)Hp1/Hp2 的濃度繼續(xù)增大，A630/525 值降低。因此，選擇100 nmol/L 的Hp1/Hp2 作為體系的最佳濃度。

圖7 Hp1/Hp2 的濃度優(yōu)化Fig.7 Optimization of Hp1/Hp2 concentration

2.8 鼠傷寒沙門氏菌測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最佳條件下，采用適配體結(jié)合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及AuNPs 比色法檢測鼠傷寒沙門氏菌。圖8a 給出了基于核酸適配體雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及納米金比色體系對不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌的紫外可見吸收光譜。吸光度A630/525 值與鼠傷寒沙門氏菌濃度在103～107CFU/mL 范圍內(nèi)可以達(dá)到良好的線性關(guān)系(圖8b)。線性方程為Y=0.18636 LgX-0.12807（R2=0.9933），檢測限為6.3×101CFU/mL。

圖8 （a）不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌紫外可見吸收光譜、（b）鼠傷寒沙門氏菌濃度與吸光度比（A630/525）關(guān)系曲線圖Fig.8 (a) UV vis absorption spectra for colorimetric assay toward S.typhimuriumwith different concentrations;(b)Linear calibration curve of the degree of absorbance ratio(A630/525) versus S.typhimurium concentration concentration

2.9 比色法對鼠傷寒沙門氏菌檢測的特異性

選用S.aureus、P.aeruginosa、S.dysenteriae、E.coli、S.thermophilus、S.flexneri幾種菌作為對照組，檢驗(yàn)本方法的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9 所示：只有鼠傷寒沙門氏菌實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)顏色變化，并且具有顯著的高吸光度比(A630/525)；對照組存在的情況下，體系的顏色在相同的條件下依然是紅色，吸光度比無顯著變化。結(jié)果表明本方法具有特異性。

圖9 不同菌存在下AuNPs 溶液的吸收比(A630/525)Fig.9 The absorption ratio (A630/525) of AuNPs solution in the presence of different strains

2.10 人工污染牛奶中的鼠傷寒沙門氏菌檢測

采用本方法檢測人工污染牛奶樣品中的鼠傷寒沙門氏菌并且與平板檢測方法對比。結(jié)果見表1：加標(biāo)回收率在90.05%～109.97%之間，與平板計(jì)數(shù)法相比，結(jié)果沒有顯著差異性，表明本方法靈敏度較高，準(zhǔn)確性較好，可用于牛奶中鼠傷寒沙門氏菌的檢測。

表1 人工污染牛奶中檢測結(jié)果Table 1 Test results of artifically infected milk samples

3 結(jié)論

本研究建立了基于鼠傷寒沙門氏菌核酸適配體的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比色檢測方法。在優(yōu)化條件下比色法檢測鼠傷寒沙門氏菌的最低檢測限為 6.3×101CFU/mL，線性范圍為103～107CFU/mL，R2=0.9933，在人工污染牛奶中加標(biāo)回收率為90.05%～109.97%。本研究通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)信號放大，反應(yīng)不需要酶的參與，不需要變溫調(diào)控，操作簡單，利用紫外光譜定量分析，也可以肉眼直接判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立一種快捷有效的鼠傷寒沙門氏菌檢測方法。