魏 萍，紀(jì)元元，張 萍，王 琦，耿天穎，于躍泓，李一經(jīng)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

腸上皮屏障（Intestinal epithelial barrier，IEB）作為機(jī)體腸道抵御病原體重要屏障[1]，包括腸上皮細(xì)胞表面理化屏障、上皮細(xì)胞層、上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白[2]，其中緊密連接蛋白ZO-1 對細(xì)胞間連接起重要作用。豬輪狀病毒可刺激腸嗜鉻細(xì)胞產(chǎn)生5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）激活腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（Enteric glial cells，EGC）產(chǎn)生神經(jīng)營 養(yǎng) 因 子（Glial cell derived neurotrophic factor，GDNF），ZO-1 表達(dá)增加[3]，但改變腸道ZO-1 分布，降低腸上皮細(xì)胞完整性，破壞腸上皮屏障[4]。EGCs 分泌s-亞硝基谷胱甘肽（Nitrosoglutathione,GSNO）促進(jìn)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)，改善緊密連接蛋白的定位參與維持IEB 完整性[5]。食淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylovorus）作為乳酸桿菌，是常見益生菌，對腸道屏障穩(wěn)定有重要作用[6]，但仍有待深入探索。Jariwala 等研究表明，眾多乳酸桿菌可改善緊密連接蛋白分布，逆轉(zhuǎn)腸道上皮細(xì)胞損傷[7]。因此，本研究通過灌胃乳鼠食淀粉乳桿菌，探索食淀粉乳桿菌是否可恢復(fù)乳鼠空腸ZO-1正常分布，提高乳鼠空腸腸上皮細(xì)胞屏障完整性，干預(yù)輪狀病毒感染導(dǎo)致的腸屏障受損，為益生菌臨床應(yīng)用探索新思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、毒株與實(shí)驗(yàn)動物

食淀粉乳桿菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院動物傳染病實(shí)驗(yàn)室從健康仔豬糞便中分離鑒定保存[8]。豬輪狀病毒OSU 株從ATCC 引進(jìn)。清潔級2日齡中國昆明系乳鼠，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，經(jīng)A 組輪狀病毒ELISA 試劑盒檢測糞便樣品RV-Ag均為陰性。

1.2 主要試劑與儀器

RNAeasy動物RNA抽提試劑盒（貨號：R0026）購自碧云天生物技術(shù)有限公司。5×All-In-One RT MasterMix（貨號：G492）購自美國ABM 公司。2×SYBRGreen qPCR Master Mix 熒光試劑（貨號：B21203）購自Bimake 公司。實(shí)時熒光定量PCR 儀（型號為Roche LightCycler480Ⅱ）購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。全蛋白提取試劑盒（貨號：W034-1-1）和BCA測蛋白濃度試劑盒（貨號：A045-4-2）均購自南京建成生物工程研究所。小鼠S-亞硝基谷胱甘肽（GSNO）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（貨號：E-22215）和小鼠5-羥色胺（5-HT）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（貨號：E-50056）購自北京誠林生物科技有限公司。一氧化氮（NO）測定試劑盒（貨號：A-013-2-1）、微量還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（貨號：A001-3）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（貨號：A007-1-1）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（貨號：A003-1）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測定試劑盒（貨號：A005-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.3 試驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)動物分為5組：正常對照組、輪狀病毒組（RV組）、食淀粉乳桿菌組（L.a組）、預(yù)防性干預(yù)組（BI 組）、治療性干預(yù)組（AI 組），每組25只，共飼喂11 d，飼喂前禁食2 h，飼喂后禁食2 h。從第1天開始，L.a組和BI組每日飼喂50 μL·d-1的食淀粉乳桿菌（107CFU·mL-1），其余各組飼喂等量生理鹽水；第4 天RV 組、BI 組和AI 組飼喂50 μL 的RV（TCID50為10-6.6·0.1 mL-1），其他組不變；第5 天開始RV 組和正常組每日灌胃50 μL 生理鹽水，L.a組、BI組和AI組飼喂50 μL·d-1食淀粉乳桿菌，連續(xù)飼喂3 d。從第8天開始，各組均飼喂50 μL生理鹽水，直至試驗(yàn)結(jié)束。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 中已有Mus-GAPDH 參考序列XM017321385.2、Mus-ZO-1 參考序列BC138028.1和Mus-GDNF參考序列U36449.1，利用Primer Pre?mier 5.0 設(shè)計熒光定量PCR 所需引物。Mus-GAP?DH 靶基因片段大小為102 bp，上游引物序列：5'ATTGTCAGCAATGCATCCTG 3'，下游引物序列：5' ATGGACTGTGGTCATGAGCC 3'；Mus-ZO-1 靶基因片段長度為198 bp，上游引物序列：5'TCATC CCAAATAAGAACAGAGC 3'，下游引物序列：5'TC ATCCCAAATAAGAACAGAGC 3'；Mus-GDNF 靶 基因片段長度為61 bp，上游引物序列：5 CTTGGGT TTGGGCTATGAAA 3'，下游引物序列：5' ACAGG AACCGCTGCAATATC 3'。引物由擎科生物科技有限公司合成。

1.5 小鼠空腸總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取各組乳鼠空腸組織20 mg，置于研磨管中，迅速加入600 μL 預(yù)冷裂解液，用微型電動勻漿器勻漿。充分勻漿后，將勻漿液用移液槍移至1.5 mL EP 管中，室溫放置3～5 min，約14 000 g 離心2 min，將上清液移至新無RNA 酶的EP 管。按照動物組織RNA 抽提試劑盒說明書操作，測定RNA 濃度。取各組空腸組織總RNA，按照HiS?cript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wip?er）說明書作反轉(zhuǎn)錄，cDNA 分裝凍存于-80 ℃，以備后續(xù)qPCR試驗(yàn)。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR

取1.5 提取的cDNA 模板和1.4 的引物擴(kuò)增ZO-1、GDNF基因。按照2×SYBR Green qPCR Master Mix 說明書操作，組內(nèi)組間各重復(fù)3 次，每次擴(kuò)增含內(nèi)參引物和陰性對照。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。取Ct值，利用2－ΔΔCt計算mRNA相對表達(dá)量。

1.7 GSNO及5-HT定量ELISA檢測

取各組等量空腸組織各20 mg放入研磨管，加入等量1×PBS，用微型電動勻漿器勻漿。勻漿后，將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中14 000 g離心10 min。取各組上清液，按照小鼠S-亞硝基谷胱甘肽（GSNO）酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書和鼠5-羥色胺（5-HT）酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書操作，測定OD450值，計算各組樣本GSNO及NO含量。

1.8 乳鼠空腸組織總蛋白提取

取各組空腸組織1 mg 放入研磨管中，各加入預(yù)冷裂解工作液（150 μL RIPA 裂解液+1.5 μL PMSF，現(xiàn)配現(xiàn)用），用微型電動勻漿器勻漿。勻漿后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中，4 ℃靜置15 min。14 000 g 離心10 min，上清液即為空腸組織總蛋白。用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，分裝-80 ℃保存，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.9 Western blot檢測

將1.8 提取的蛋白與2×上樣緩沖液1∶1 煮樣變性，然后經(jīng)SDS-PAGE電泳切下目的片段轉(zhuǎn)印，再用5%脫脂乳封閉，孵育一抗，4 ℃過夜，然后孵育二抗1 h，最后將NC 膜放入化學(xué)發(fā)光呈像設(shè)備中，在膜表面滴加ECL發(fā)光液，立即曝光。

1.10 空腸組織免疫組化

取乳鼠各組空腸組織2 cm 放入10%中性甲醛中固定24 h 后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。然后按照彭科[9]方法進(jìn)行免疫組化。

1.11 空腸組織抗氧化指標(biāo)測定

取攻毒后1～4 d 各組乳鼠空腸組織各20 mg放入研磨管中，按說明書加入1×PBS 研磨，離心取上清液，使用商業(yè)試劑盒檢測中國昆明鼠乳鼠空腸中NO、GSH、SOD、MDA、GSH-Px、CAT含量。

1.12 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2010 統(tǒng)計數(shù)據(jù)，應(yīng)用Image J 軟件分析平均光密度值，應(yīng)用GraphPad Prisms 分析結(jié)果，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)處理分析組間差異，*代表差異顯著（P＜0.05），**代表差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 食淀粉乳桿菌對乳鼠空腸內(nèi)ZO-1 mRNA 水平的影響

如圖1 所示，L.a 組ZO-1mRNA 相對表達(dá)量變化呈上升趨勢，各時間段均高于其他組。RV 組ZO-1 mRNA 相對表達(dá)量變化均為先升后降，飼喂第6 天ZO-1 mRNA 相對表達(dá)量達(dá)到最大值。BI 組的ZO-1 mRNA 相對表達(dá)量變化不明顯，整體高于RV 組和AI 組。AI 組ZO-1 mRNA 相對表達(dá)量呈下降趨勢，攻毒后第1天明顯高于RV組（P＜0.01）。

圖1 感染輪狀病毒后各組ZO-1 mRNA相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of ZO-1 mRNA post infection with rotavirus

2.2 食淀粉乳桿菌對乳鼠空腸內(nèi)GDNF mRNA 水平的影響

如圖2所示，L.a組GDNF mRNA相對表達(dá)量變化呈上升趨勢，且明顯高于其他4 組。RV 組和BI組GDNF mRNA 相對表達(dá)量變化均先升后降。AI組GDNF mRNA 相對表達(dá)量呈上升趨勢。

圖2 感染輪狀病毒后各組GDNF mRNA相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of GDNF mRNA post infection with rotavirus

2.3 乳鼠空腸5-HT含量變化

如圖3所示，與對照組相比，L.a組5-HT含量呈下降趨勢，但普遍高于其他組（P＜0.01）。RV 組5-HT含量在各時間段高于對照組，低于BI組和AI組。BI 組5-HT 含量呈下降趨勢，AI 組5-HT 含量呈先升后降趨勢；BI 組在感染輪狀病毒后各時間段均高于AI組。

圖3 感染輪狀病毒后各組5-HT含量Fig.3 Concentration of 5-HT in each group after rotavirus infection

2.4 乳鼠空腸內(nèi)GSNO含量變化

如圖4所示，感染病毒后，L.a組GSNO含量呈現(xiàn)上升趨勢，與對照組對比差異極顯著（P＜0.01），RV 組、BI 組 和AI 組GSNO 含量呈先升后降趨勢，RV 組和BI 組GSNO 含量在飼喂第7 天達(dá)到最大值，AI組GSNO含量在飼喂第6天達(dá)到最大值。感染病毒后，RV 組GSNO 含量變化不明顯，與正常對照組對比差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 感染輪狀病毒后各組GSNO表達(dá)量Fig.4 Expression of GSNO post infection with rotavirus

2.5 乳鼠空腸內(nèi)ZO-1、GDNF、GFAP 蛋白含量變化

如圖5 所示，在攻毒后第1天，各組ZO-1蛋白表達(dá)量和GFAP、GDNF整體趨勢相似，均為L.a組表達(dá)量最高，RV組、BI組和AI組表達(dá)量較低。

圖5 乳鼠感染RV后第1天ZO-1、GDNF、GFAP蛋白表達(dá)量Fig.5 Expression of ZO-1,GDNF and GFAP protein in suckling mice on the first day after RV infection

如圖6所示，攻毒后第2天，與感染輪狀病毒后變化趨勢一致，仍是L.a 組3 種蛋白表達(dá)量高，RV組ZO-1蛋白表達(dá)量高于正常對照組，GFAP和GDNF蛋白表達(dá)量變化趨勢一致。

圖6 乳鼠感染RV后第2天ZO-1、GDNF、GFAP蛋白表達(dá)量Fig.6 Expression of ZO-1,GDNF and GFAP protein in suckling mice on the second day after RV infection

如圖7所示，在感染輪狀病毒后第3天，L.a組ZO-1 蛋白表達(dá)量最高，BI 組GFAP 蛋白表達(dá)量最高，AI組GDNF蛋白表達(dá)量最高。

圖7 乳鼠感染RV后第3天ZO-1、GDNF、GFAP蛋白表達(dá)量Fig.7 Expression of ZO-1,GDNF and GFAP protein in suckling mice on the third day after RV infection

如圖8所示，在攻毒后第4天，L.a組3種蛋白表達(dá)量均最高，RV 組GFAP 蛋白表達(dá)量超過BI 組和AI組，RV組GDNF蛋白表達(dá)量最低。

圖8 乳鼠感染RV后第4天ZO-1、GDNF、GFAP蛋白表達(dá)量Fig.8 Expression of ZO-1,GDNF and GFAP protein in suckling mice on the fourth day after RV infection

2.6 乳鼠空腸免疫組化

如圖9 所示，緊密連接蛋白ZO-1 棕黃色粗顆粒主要分布在腸絨毛邊緣，上皮細(xì)胞膜外側(cè)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有少量分布。如圖10 所示，各組平均光強(qiáng)度值從高到低依次是L.a 組、BI 組、AI 組、RV組、對照組。L.a 組棕黃色顆粒變深，表達(dá)更連續(xù)，分布更均勻（P＜0.0001）。RV 組棕黃色顆粒變淺，表達(dá)不連續(xù)，分布不均勻（P＜0.0001）。BI 組棕黃色顆粒較RV組顏色變化不明顯，表達(dá)較之連續(xù)，分布較之明顯（P＜0.001）。

圖9 乳鼠感染PRV后ZO-1蛋白免疫組化結(jié)果（放大倍數(shù)：400倍）Fig.9 Immunohistochemical results of ZO-1 protein in suckling mice infected with PRV(×400)

圖10 乳鼠感染PRV后ZO-1蛋白平均光密度值Fig.10 Average optical density of ZO-1 protein in suckling mice infected with PRV

2.7 乳鼠空腸中抗氧化指標(biāo)含量變化

結(jié)果如圖11所示。

由圖11 可知，NO 與MDA 含量變化趨勢一致，L.a 組NO 與MDA 含量與對照組相比，無明顯差異（P＞0.05），各時間段含量較低且無明顯變化；RV組先升后降，整體含量均高于其他組；BI組與AI 組含量均高于L.a 組。CAT 和GSH-Px 含量變化趨勢一致，與對照組相比，L.a 組在各時間段含量均最高；RV 組含量呈先升后降趨勢，均為攻毒后第2 天達(dá)到峰值；AI 組含量在攻毒后第1 天最高，BI 組含量變化不明顯。SOD 和GSH 含量變化趨勢一致，L.a組含量呈先降后升趨勢；RV組的含量呈先升后降趨勢；BI 組含量基本呈上升趨勢；AI 組SOD含量呈下降趨勢，GSH含量呈先降后升趨勢。

圖11 感染輪狀病毒后各組NO、MDA、CAT、SOD、GSH、GSH-Px含量Fig.11 Concentrations of NO,MDA,CAT,SOD,GSH and GSH-Px in each group after rotavirus infection

3 討論

多種腸道病毒均可刺激EC細(xì)胞釋放5-HT，激活EGCs，如腺病毒-41及PEDV[10-11]。RV同樣具有此功能，通過感染絨毛頂部和中間成熟腸上皮細(xì)胞，腸毒素NSP4 刺激EC 細(xì)胞釋放5-HT[12]，激活EGCs。本研究結(jié)果表明，攻毒后RV 組的5-HT 含量均高于正常對照組，證明輪狀病毒可刺激EC 細(xì)胞釋放5-HT，攻毒后第3～4天，GFAP表達(dá)量高于正常對照組，GFAP 表達(dá)增多是激活EGCs 的標(biāo)志，說明輪狀病毒通過上調(diào)5-HT 表達(dá)量激活EGCs，與上述結(jié)論一致。從5-HT 釋放到激活EGCs 有時間差，說明在乳鼠空腸內(nèi)5-HT 可能需達(dá)到一定濃度才激活EGCs。Engevik等研究證明并非所有腸道益生菌均促進(jìn)5-HT釋放，但人源性雙歧桿菌可上調(diào)哺乳動物釋放5-HT[13]。本研究中，L.a組5-HT表達(dá)量在各時間段均高于其他組，說明食淀粉乳桿菌同樣具有促進(jìn)腸道中EC細(xì)胞釋放5-HT 的功能。攻毒后各時間段，BI 組和AI 組5-HT和GFAP表達(dá)量呈正相關(guān)，均高于RV組，說明食淀粉乳桿菌可通過上調(diào)5-HT 表達(dá)量激活更多EGCs，干預(yù)輪狀病毒感染。

EGCs 分泌的促炎或抗炎因子可調(diào)節(jié)腸上皮屏障功能，如NO、GDNF和GSNO，通過不同機(jī)制對腸屏障功能起保護(hù)作用[14]。GDNF 可直接作用于腸上皮細(xì)胞，通過抑制TNF-α 和IL-1β 等多種促炎因子釋放起抗炎作用，維持腸上皮屏障完整性。Boyen等研究表明，從患潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病病例腸活檢的組織學(xué)檢查中，GFAP、S100B 和發(fā)炎區(qū)域的GDNF表達(dá)量有所增加[15]。本研究中，攻毒后第3～4天，RV組GFAP和GDNF蛋白表達(dá)量均高于正常對照組，與上述結(jié)論一致。益生菌可直接調(diào)節(jié)機(jī)體腸上皮屏障功能，但維持腸上皮屏障完整性的調(diào)節(jié)因子尚未明確。BI 組與AI 組在攻毒前3 d，GDNF蛋白表達(dá)量均高于RV組，說明食淀粉乳桿菌可通過上調(diào)GDNF表達(dá)量維持腸上皮屏障完整性，干預(yù)輪狀病毒感染。然而，是否通過抑制促炎因子釋放發(fā)揮維持腸上皮屏障功能，需進(jìn)一步研究。EGCs 來源的GSNO 通過改善如ZO-1、Occudin 等緊密連接蛋白分布維持腸上皮屏障功能[10]。本研究中，攻毒后RV 組GSNO 含量顯著下調(diào)，揭示輪狀病毒可能通過抑制GSNO表達(dá)破壞腸上皮屏障完整性。BI 組和AI 組GSNO 含量則高于RV 組，且免疫組化結(jié)果表明，BI 組和AI 組ZO-1蛋白較RV組排列緊密、分布均勻，說明食淀粉乳桿菌可通過上調(diào)GSNO表達(dá)量改善緊密連接蛋白分布，維持腸上皮屏障完整性，干預(yù)輪狀病毒感染。

正常情況下，GSNO 在體內(nèi)處于動態(tài)平衡。GSH亞硝基化和氧化反應(yīng)取決于細(xì)胞內(nèi)NO和GSH濃度。在NO低濃度和GSH高濃度時，機(jī)體趨向于GSH 亞硝基化反應(yīng)，GSNO 表達(dá)量高；反之GSNO表達(dá)量低[16]。本研究中，RV 組NO 與GSH 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，揭示輪狀病毒可能通過促進(jìn)GSH 氧化反應(yīng)抑制GSNO 表達(dá)，間接破壞腸上皮屏障完整性。BI組NO高表達(dá)量和GSH低表達(dá)量，揭示食淀粉乳桿菌可能是通過促進(jìn)GSH 亞硝基化反應(yīng)，上調(diào)GSNO表達(dá)，降低腸道損傷，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，干預(yù)輪狀病毒感染。Engevik 等研究證明機(jī)體內(nèi)過氧化物含量過高，誘導(dǎo)緊密連接蛋白和黏附連接蛋白從細(xì)胞間連接轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，破壞腸上皮屏障完整性[13]。本研究結(jié)果表明，輪狀病毒可通過感染乳鼠腸上皮細(xì)胞下調(diào)CAT、GSH-Px 表達(dá)量，導(dǎo)致過氧化物含量過高，破壞腸上皮屏障完整性，與上述結(jié)論一致。Hagbom 等報道乳酸菌可直接在腸道發(fā)揮抗氧化作用，通過維持腸道氧化還原平衡狀態(tài)維持腸道健康，改善腸道損傷[13]。BI組和AI組證明食淀粉乳桿菌通過上調(diào)CAT、GSH-Px表達(dá)量，降低乳鼠空腸內(nèi)過氧化物濃度，維持腸上皮屏障完整性，干預(yù)輪狀病毒感染，但未能直接觀察到緊密連接蛋白從細(xì)胞間連接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，需進(jìn)一步研究。

ZO-1 作為細(xì)胞間連接功能的重要蛋白和細(xì)胞骨架，是腸上皮屏障形成的關(guān)鍵因素。劉芳寧研究表明hRV 感染Gn 豬后3～6 d 腹瀉越嚴(yán)重，回腸上皮中TJ和AJ蛋白含量越高，原因是感染后損傷的腸上皮細(xì)胞補(bǔ)償性增生[17]。本研究中，攻毒后1～4 d，RV 組ZO-1 蛋白表達(dá)增多，與上述結(jié)論一致，而mRNA 表達(dá)量低于對照組，原因是樣品同時采集，而mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)需要時間。BI 組ZO-1 蛋白表達(dá)量在攻毒后第1 天顯著低于RV 組，間接說明食淀粉乳桿菌降低輪狀病毒感染造成的腸上皮損傷及增生。然而，本研究僅檢測部分TJ 和AJ 蛋白，并不能全面說明問題，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，食淀粉乳桿菌可通過激活EGCs 分泌GDNF和GSNO，上調(diào)ZO-1表達(dá)，維持乳鼠空腸中ZO-1 正常分布；通過過氧化物酶分解大量過氧化物，提高乳鼠空腸抗氧化能力，兩者共同作用，維持腸上皮屏障完整性，干預(yù)輪狀病毒感染，為后續(xù)研究益生菌干預(yù)輪狀病毒感染提供思路。