劉莉 包名家 王彬 劉丹丹 馬永娟 張維娜

佳木斯市疾病預(yù)防控制中心 154007

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的具有高度傳染性的急性呼吸道傳染病。由于流感病毒基因的高度變異性，人群對(duì)其普遍易感，易造成人群反復(fù)感染、發(fā)病率高，可在世界范圍內(nèi)廣泛流行。

流感的病原學(xué)監(jiān)測(cè)是流感監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容，病毒分離培養(yǎng)是病原學(xué)監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)［1］，是流感病毒監(jiān)測(cè)最常用和最可靠的方法之一。佳木斯市疾病預(yù)防控制中心流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法對(duì)流感樣病例標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，陽(yáng)性標(biāo)本接種MDCK 細(xì)胞（Madin-Darby Canine Kidney cells，狗腎細(xì)胞）和SPF（specific pathogen free，無(wú)特定病原體）雞胚雙腔進(jìn)行病毒分離。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集 樣本來(lái)自佳木斯市兩家流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院（佳木斯市中心醫(yī)院和佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院）。樣本送到實(shí)驗(yàn)室后存放至4 ℃冰箱保存，如未及時(shí)檢測(cè)存放于-70 ℃保存待用。核酸檢測(cè)流感病毒陽(yáng)性標(biāo)本最好在24 h 內(nèi)利用狀態(tài)良好的MDCK 細(xì)胞或SPF 雞胚進(jìn)行病毒分離。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 SPF 雞胚和MDCK 細(xì)胞由黑龍江省疾病預(yù)防控制中心提供，TPCK 胰酶，DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：AE29005267）、胎牛血清（貨號(hào)：1841924）等細(xì)胞培養(yǎng)試劑均為美國(guó)GIBCO 公司產(chǎn)品；ABI 7500 型熒光定量PCR 儀為美國(guó)AB 公司產(chǎn)品；核酸提取試劑RNeasy Mini Kit（貨號(hào)：SDKF60101D）為江蘇碩世公司產(chǎn)品。流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清和參考抗原由國(guó)家流感中心配發(fā)，人O 型血紅細(xì)胞來(lái)源于本中心工作人員，使用濃度為1%。

1.3 MDCK 細(xì)胞接種 核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣本用0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾后接種到已經(jīng)清洗的75%～90%生長(zhǎng)良好的成片細(xì)胞中，放入5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1～2 h，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶用PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，加入5 ml含終濃度為2 μg/ml TPCK 胰酶的病毒生長(zhǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于35 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 雞胚接種 按常規(guī)雞胚雙腔培養(yǎng)法，取9～11 日齡SPF 雞胚接種，3 胚蛋/標(biāo)本，置于35 ℃孵箱孵育72 h 后，置-20 ℃冰箱1～2 h，按常規(guī)分別收獲尿囊液和羊水。

1.5 分離物鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲，當(dāng)75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲，雞胚收獲尿囊液和羊水。培養(yǎng)物收獲后采用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（HA）和紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）方法進(jìn)行病毒型別鑒定。HA 滴度達(dá)到8 及以上時(shí)，直接進(jìn)行HI 試驗(yàn)；若HA 滴度小于8 則對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行10-1～10-3稀釋后，繼續(xù)進(jìn)行病毒傳代培養(yǎng)，直到HA 滴度大于等于8。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制系統(tǒng)流感監(jiān)測(cè)信息平臺(tái)，數(shù)據(jù)信息錄入Excel 2007，應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用例（百分比）表示，采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離情況 2014.4.1—2020.3.31 流感病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)為811 份。6 個(gè)監(jiān)測(cè)年中MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒，每個(gè)年份之間分離率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=64.640，P＜0.01）；分離率高的年份為2015.4.1—2016.3.31，分離率為60.00%；分離率最低的年份為2019.4.1—2020.3.31，分離率為23.12%。雞胚雙腔培養(yǎng)法分離流感病毒，各年監(jiān)測(cè)中分離率差異有統(tǒng)計(jì)意義（χ2=18.429，P＜0.01），2014.4.1—2015.3.31 分離率為0%，2019.4.1—2020.3.31分離率最高，為33.87%。MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒總分離率為40.69%，雞胚雙腔培養(yǎng)法總分離率為21.30%，兩種培養(yǎng)流感病毒的方法分離率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.343，P＜0.01），MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法分離率優(yōu)于雞胚雙腔培養(yǎng)法。見(jiàn)表1。

表1 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法和雞胚雙腔培養(yǎng)法分離流感病毒情況

2.2 亞型分布情況 MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感毒株330 株，其中甲型H1N1 108 株、甲型H3N2 122 株、乙型BV 57 株、乙型BY 43 株；雞胚雙腔培養(yǎng)法分離流感毒株95 株，其中甲型H1N1 59 株、甲型H3N2 0 株、乙型BV 19 株、乙型BY 17株。見(jiàn)表2。

表2 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法和雞胚雙腔培養(yǎng)法分離流感毒株亞型情況（株）

2.3 血凝效價(jià)情況 雞胚雙腔培養(yǎng)法分離出流感毒株95 株，對(duì)應(yīng)樣本MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法全部分離出流感病毒，并且病毒血凝效價(jià)滴度16 共9 株，≥32 共86 株。見(jiàn)表3。

表3 雞胚雙腔培養(yǎng)法毒株對(duì)應(yīng)樣本MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法分離毒株血凝滴度情況

2.4 毒株代數(shù)情況 MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感毒株330 株，二次傳代培養(yǎng)分離出毒株數(shù)最多185 株，四次傳代培養(yǎng)分離毒株數(shù)最少8 株；雞胚雙腔培養(yǎng)法分離出毒株95 株，二次傳代培養(yǎng)分離出毒株最多為70 株，一次傳代培養(yǎng)分離出毒株數(shù)最少6 株。從表4 可以看出，MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法和雞胚雙腔培養(yǎng)法都是二次傳代分離毒株數(shù)多。

表4 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法和雞胚雙腔培養(yǎng)法分離流感病毒毒株代數(shù)情況

3 討 論

病毒分離和鑒定是診斷病毒感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對(duì)監(jiān)測(cè)流行病的新動(dòng)向、研究新疾病、新病毒以及新病毒與疾病的關(guān)系都有重要作用。目前多采用MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法和雞胚雙腔培養(yǎng)法進(jìn)行流感病毒分離。佳木斯市MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒各年份之間分離率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=64.640，P＜0.01）。2015.4.1—2016.3.31 分離率 最高為60.00%，流行的型別以乙型BV 為主（55 株），甲型H3N2 為輔（29 株）（表2）。而2019.4.1—2020.3.31 分離率最低，為23.12%，分離率低的原因可能與2019 年末流行新型冠狀病毒有關(guān)，流感就診患者量減少，年后居家隔離，流動(dòng)性減少有關(guān)。雞胚雙腔培養(yǎng)法分離率最高的年份為2019.4.1—2020.3.31，為33.87%。推測(cè)疫情原因，核酸檢測(cè)陽(yáng)性率低，接種樣本量減少，但毒株陽(yáng)性率不低，均為甲型H1N1亞型，甲型H1N1 亞型對(duì)雞胚很敏感，楊式芹等［2］報(bào)道甲型H1N1 流感病毒對(duì)雞胚培養(yǎng)的分離率高于其他季節(jié)性流感病毒，這也可能是分離率高的原因。MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法和雞胚雙腔培養(yǎng)法分離率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.343，P＜0.01），MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法分離率優(yōu)于雞胚雙腔培養(yǎng)法分離率，這與劉建軍等［3］報(bào)道MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒比雞胚雙腔培養(yǎng)法敏感報(bào)道相符。雞胚雙腔培養(yǎng)法分離出毒株的樣本對(duì)應(yīng)的MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法全部分離出毒株，并且MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法滴度多數(shù)≥32（表3），推測(cè)MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法血凝滴度≥32的樣本接種到雞胚雙腔中，更容易分離出流感病毒，這為以后提高雞胚雙腔法流感病毒分離率提供參考依據(jù)。

1998 年以后的甲型H3N2 亞型病毒的分離多采用MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法［4］。病毒的相變異導(dǎo)致甲型H3N2 亞型僅對(duì)MDCK細(xì)胞敏感，使雞胚雙腔法分離甲型H3N2亞型的陽(yáng)性率極低［5-7］，所以本實(shí)驗(yàn)中為了提高流感病毒的分離率，我們用雞胚雙腔法接種樣本時(shí)，沒(méi)有選擇核酸陽(yáng)性的甲型H3N2亞型的樣本。乙型毒株則對(duì)兩種宿主系統(tǒng)都敏感，因此必須同時(shí)使用雞胚雙腔和MDCK 細(xì)胞兩種宿主系統(tǒng)分離流感病毒。MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒可以保證病毒抗原性與原始毒株相近，且可以長(zhǎng)時(shí)間保存。

MDCK細(xì)胞培養(yǎng)的是活的病毒株，所以流感病毒標(biāo)本在采集、運(yùn)輸保存過(guò)程中應(yīng)注意不要被滅活，另外MDCK 細(xì)胞的代數(shù)和敏感度與流感病毒分離有很大關(guān)系［8］。本實(shí)驗(yàn)中兩種培養(yǎng)法分離流感病毒均在二次傳代分離毒株數(shù)高，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法二次傳代毒株構(gòu)成比為56.06%（185/330），雞胚雙腔培養(yǎng)法二次傳代毒株構(gòu)成比為73.68%（70/95）（表4）。從省級(jí)實(shí)驗(yàn)室取回20 代左右的MDCK 細(xì)胞后，及時(shí)培養(yǎng)，凍存低代數(shù)的細(xì)胞。當(dāng)MDCK 細(xì)胞傳代數(shù)接近30 代時(shí)候，復(fù)蘇凍存的MDCK細(xì)胞，以保障提高細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性。

目前中醫(yī)藥防治的整體觀(guān)，是預(yù)防、控制、治療流感的嶄新思路。通過(guò)藥物、飲食、調(diào)息等多種療法，輔助正氣、補(bǔ)虛瀉實(shí)、調(diào)和陰陽(yáng)，提高抗病能力［9］，但流感疫苗是目前預(yù)防流感最有效的手段。流感疫苗仍然來(lái)自雞胚分離株，我們需要從雞胚株中篩選代表株為疫苗推薦提供候選毒株，但是近來(lái)流行的甲型H3N2 亞型流感病毒很難在雞胚中擴(kuò)增，并且在雞胚中病毒產(chǎn)生的適應(yīng)性突變能造成毒株抗原性的改變，因而目前推薦合適的甲型H3N2疫苗組分也是世界衛(wèi)生組織遇到的挑戰(zhàn)［7］，SPF 雞胚雙腔法分離病毒，其主要困難在于雞胚的來(lái)源不穩(wěn)定、個(gè)體差異大、供貨周期長(zhǎng)和運(yùn)輸成本高等問(wèn)題，且接種方法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求較高，故多數(shù)實(shí)驗(yàn)室該法病毒分離率一直較低［10］。為了提高流感病毒分離率，實(shí)驗(yàn)室一直在摸索提高病毒分離率的方法，為流感防控提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突。