侯泰東，夏阿林，黃煒

(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng),422000)

休閑豆干作為人們?nèi)粘ＯM(fèi)最大的豆制品種類(lèi)之一[1]，是一種深受消費(fèi)者喜愛(ài)的小型包裝食品，主要以大豆為原料，經(jīng)鹵制、調(diào)味、滅菌后包裝成精小方便的即食食品[2-3]。食品中各項(xiàng)指標(biāo)的含量及變化情況與食品的品質(zhì)息息相關(guān)。食品中的微生物代謝能使還原糖、蛋白質(zhì)等降解成為醋酸和乳酸等，導(dǎo)致總酸含量變化，總酸的變化會(huì)影響食品的品質(zhì)，因此，在食品品質(zhì)檢測(cè)中總酸的含量也常常作為判斷食品品質(zhì)合格與否的重要理化指標(biāo)之一[4]。對(duì)于總酸的測(cè)定，目前傳統(tǒng)方法主要是酸堿滴定法和pH電位法，這些傳統(tǒng)方法大多不能保證在樣品無(wú)損的情況下短時(shí)間實(shí)現(xiàn)對(duì)大批量樣品進(jìn)行測(cè)定等要求，且對(duì)檢測(cè)人員的操作精準(zhǔn)度要求較高，存在耗時(shí)費(fèi)力、試劑消耗量大、污染環(huán)境等缺點(diǎn)。并且休閑豆干成分復(fù)雜，會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾。因此，有必要探索一種快速無(wú)損測(cè)定休閑豆干總酸的方法。相比于其他分析儀器，低場(chǎng)核磁共振(LF-NMR)對(duì)氫質(zhì)子的存在環(huán)境及狀態(tài)比較敏感，在磁場(chǎng)和射頻脈沖作用下，不同物理化學(xué)環(huán)境下的氫質(zhì)子產(chǎn)生不同的自旋回波信號(hào)，因此，可以通過(guò)橫向弛豫譜來(lái)研究物質(zhì)的總酸含量等與之相關(guān)的其他性質(zhì)[5-10]。采用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以簡(jiǎn)便、快速地從龐大復(fù)雜數(shù)據(jù)中最大限度地提取有效信息，并獲得物質(zhì)內(nèi)在結(jié)構(gòu)、成分等與其性能之間存在的內(nèi)在關(guān)系，對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)的解釋、判別以及預(yù)測(cè)均有幫助，為各種光譜技術(shù)結(jié)合為復(fù)雜體系的分析提供了新思路、新方法[11-14]。因此，采用低場(chǎng)核磁共振結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)總酸的含量進(jìn)行快速預(yù)測(cè)并對(duì)其進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，可以在保證無(wú)損前提下提高檢測(cè)速度，近年來(lái)，低場(chǎng)核磁共振已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)中[15-18]。本文利用LF-NMR獲得的橫向弛豫時(shí)間信號(hào)譜結(jié)合偏最小二乘(PLS)和誤差反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP-ANN)算法建立多元校正模型, 相比于傳統(tǒng)的酸度測(cè)定方法，它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)總酸含量的無(wú)損、準(zhǔn)確、快速預(yù)測(cè)，為儲(chǔ)存過(guò)程中快速、準(zhǔn)確、無(wú)損地監(jiān)測(cè)休閑豆干品質(zhì)提供一種有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

臺(tái)式磁共振分析儀(MQC+23，牛津儀器科技(上海)有限公司)；CP323C分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。休閑豆干樣品全部購(gòu)于邵陽(yáng)市不同的大型超市。氫氧化鈉(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；酚酞指示劑(1.6%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 低場(chǎng)核磁共振檢測(cè)

休閑豆干樣品均為質(zhì)量約15 g的獨(dú)立小包。4個(gè)月內(nèi)購(gòu)買(mǎi)5個(gè)批次的同一品牌樣品，共收集150個(gè)樣品，其中某個(gè)批次收集30個(gè)樣品。樣品儲(chǔ)存溫度為室溫。

待測(cè)休閑豆干樣品無(wú)需任何預(yù)處理，連包裝直接裝在直徑為26 mm的圓柱形玻璃測(cè)量管中。將其置于低場(chǎng)核磁共振分析儀的測(cè)量池中，并在測(cè)量前預(yù)熱10 min。儀器磁體的溫度為32 ℃，氫共振頻率為23 MHz，信號(hào)采集采用CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill)脈沖序列。主要參數(shù)設(shè)置如下：P90°(90°脈沖時(shí)間)為5.45 μs，P180°(180°脈沖時(shí)間)為10.9 μs，SW(掃描寬度)為1 000 kHz，RD(重復(fù)延遲)為1 000 ms，NS(掃描次數(shù))為16次，NECH(回波次數(shù))為512次，TAU(脈沖間隔)為150 μs。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量。取平均值作為測(cè)量結(jié)果。T2譜是利用低場(chǎng)核磁共振分析儀自帶的WinDxp軟件對(duì)回波信號(hào)的多指數(shù)弛豫譜進(jìn)行反演得到的曲線。光譜數(shù)據(jù)的默認(rèn)輸出是128個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

1.3 總酸參考值

參照“食品中總酸的測(cè)定中的酸堿滴定法”(GB/T 12456—2008)[19]，稍做修改，測(cè)定總酸含量。將經(jīng)過(guò)低場(chǎng)核磁共振分析儀檢測(cè)后的樣品去除包裝后，直接稱(chēng)質(zhì)量(精確至0.001 g)后，根據(jù)國(guó)標(biāo)中對(duì)固體樣品測(cè)量的方法進(jìn)行測(cè)量[19]。根據(jù)酸堿滴定原理，以酚酞為指示劑，用0.01 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以滴定至微紅色30 s不褪色為滴定終點(diǎn)，通過(guò)氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的消耗量計(jì)算總酸度。根據(jù)“非發(fā)酵性豆制品及面筋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法”(GB/T 5009.51—2003)中的規(guī)定[20]，休閑豆干中含多種有機(jī)酸，總酸測(cè)定中以乳酸計(jì)算。所有樣品在進(jìn)行參考值分析前都需要進(jìn)行低場(chǎng)核磁共振分析儀測(cè)量，以獲取該樣品譜圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

偏最小二乘法(PLS)和反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP-ANN)程序在Octave軟件平臺(tái)上自行編寫(xiě)和運(yùn)行。采用留一交叉驗(yàn)證方法，得到了PLS模型的最優(yōu)主成分個(gè)數(shù)[21-22]。為了衡量模型的預(yù)測(cè)性能，引入了校正均方根誤差(RMSEC)和預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)，并分別定義如下[23-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酸參考值分析

從收集到的樣品中隨機(jī)選擇92個(gè)樣品用于建立總酸含量的校準(zhǔn)模型。從這些選取的樣品中再隨機(jī)抽取69個(gè)樣本作為校準(zhǔn)集。剩下的23個(gè)樣品作為預(yù)測(cè)集。樣品經(jīng)低場(chǎng)核磁共振儀無(wú)損測(cè)定后，再用國(guó)標(biāo)方法對(duì)參考值進(jìn)行分析[19]。總酸含量參考值統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1的分析結(jié)果，總酸含量的參考值分布在0.910 9～1.452 5范圍內(nèi)。參考值范圍覆蓋了休閑豆腐干中總酸所有的含量。

表1 豆干總酸參考值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistics of reference value of total acidity in dried tofu

2.2 總酸校正模型

根據(jù)算法確定了最優(yōu)主成分?jǐn)?shù)為4。用PLS方法對(duì)69個(gè)校正集休閑豆干樣品建立校正模型，利用沒(méi)有參與建模的23個(gè)預(yù)測(cè)集豆干樣品對(duì)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。圖1顯示了模型預(yù)測(cè)值與參考值之間的關(guān)系。如圖1(a)所示，通過(guò)PLS模型預(yù)測(cè)的總酸值與參考值有比較好的相關(guān)性。采用BP-ANN建立了休閑豆干樣品校正集的多元校正模型。采用雙隱層BP-ANN方法建立多元校正模型，即模型含有1個(gè)輸入層，其節(jié)點(diǎn)數(shù)為128(即T2點(diǎn)數(shù))；2個(gè)隱含層：隱含層1節(jié)點(diǎn)數(shù)選為11，隱含層2節(jié)點(diǎn)數(shù)為5；1個(gè)輸出層，其節(jié)點(diǎn)數(shù)為1。用未參與建模的23個(gè)預(yù)測(cè)集樣本對(duì)BP-ANN校準(zhǔn)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果如圖1(b)所示，從圖中可以看出，通過(guò)BP-ANN模型預(yù)測(cè)的總酸值與參考值有較好的相關(guān)性。

圖1 PLS和BP-ANN方法對(duì)校正集及預(yù)測(cè)集樣品的預(yù)測(cè)值與參考值的相關(guān)性Fig.1 Correlation between reference and predicted values of total acid content for PLS (a) and BP-ANN (b)

通常采用校正集相關(guān)系數(shù)rc、預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)rp，RMSEC以及RMSEP來(lái)評(píng)價(jià)模型的精確度和準(zhǔn)確性[25]，若rc和rp越大，RMSEC和RMSEP越小，則表明預(yù)測(cè)模型越準(zhǔn)確。表2顯示了2種方法的結(jié)果。從表2可以看出，對(duì)總酸的預(yù)測(cè)，PLS模型的rc和RMSEC分別為0.920 7和0.054 5，rp和RMSEP分別為0.961 7和0.041 9；BP-ANN模型的rc和標(biāo)準(zhǔn)偏差RMSEC分別為0.979 9和0.032 2，rp和標(biāo)準(zhǔn)偏差RMSEP分別為0.978 1和0.037 3。用PLS和BP-ANN模型，RMSEC和RMSEP都較低(<0.055)，rc和rp的相關(guān)系數(shù)都較高(>0.9)。總的來(lái)說(shuō)，2種模型均可以較準(zhǔn)確地對(duì)休閑豆干中總酸含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，2種矯正模型獲得的酸度預(yù)測(cè)值與國(guó)標(biāo)方法測(cè)得的參考值之間均具有較好的線性相關(guān)性，且BP-ANN模型的性能要優(yōu)于PLS模型。實(shí)測(cè)值與通過(guò)算法根據(jù)橫向弛豫時(shí)間圖譜所得出的預(yù)測(cè)值之間的線性關(guān)系不強(qiáng)。然而，在非線性數(shù)據(jù)的定量分析中，BP-ANN方法普遍優(yōu)于PLS方法。也就是說(shuō)，分析數(shù)據(jù)的線性度越好，PLS方法的預(yù)測(cè)效果越好；線性度越差，BP-ANN方法的預(yù)測(cè)效果越好。結(jié)果顯示，利用LF-NMR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)休閑豆干的總酸含量建立的定量預(yù)測(cè)模型具有較高地準(zhǔn)確性和較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力，可以用來(lái)替代傳統(tǒng)化學(xué)方法對(duì)豆干中總酸含量進(jìn)行無(wú)損測(cè)定，且能夠保證常規(guī)分析方法對(duì)于精度的要求。由于BP-ANN模型優(yōu)于PLS模型，因此，選用BP-ANN模型對(duì)休閑豆干總酸含量進(jìn)行了儲(chǔ)存變化動(dòng)力學(xué)研究。

表2 PLS和BP-ANN預(yù)測(cè)休閑豆干總酸的統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistics of total acid in leisure dried tofu predicted with PLS and BP-ANN

2.3 儲(chǔ)存動(dòng)力學(xué)分析

從某個(gè)批次(同一生產(chǎn)日期)樣本中隨機(jī)抽取20個(gè)作為動(dòng)力學(xué)分析樣本。在大約400 d內(nèi)，每隔一段時(shí)間使用低場(chǎng)核磁共振儀測(cè)量樣品。使用2.2中建好的BP-ANN模型用于預(yù)測(cè)這些樣品的總酸值。圖2為20個(gè)休閑豆干樣品貯藏時(shí)間與預(yù)測(cè)總酸值關(guān)系的散點(diǎn)圖。在圖2中，x軸是存儲(chǔ)時(shí)間，y軸是樣本編號(hào)，z軸是BP-ANN總酸校正模型得到的總酸預(yù)測(cè)值。從圖2可見(jiàn)：在約400 d內(nèi)，休閑豆干的總酸含量大致呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，少數(shù)樣品在200 d(約7個(gè)月)左右開(kāi)始隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)波動(dòng)，呈現(xiàn)出總體下降趨勢(shì)。這說(shuō)明，在生產(chǎn)日期之后的約7個(gè)月之內(nèi)的休閑豆干處于品質(zhì)穩(wěn)定期，在此時(shí)間范圍內(nèi)的休閑豆干較易儲(chǔ)存，且品質(zhì)變化不顯著，基本與此前的研究中的休閑豆干貨架期相符合[26]。而少數(shù)休閑豆干樣品在約200 d(約7個(gè)月)總酸含量開(kāi)始發(fā)生變化。這可能是由于隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，休閑豆干中一些化學(xué)成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，如在休閑豆干樣品中的細(xì)菌與微生物酶作用下，蛋白質(zhì)在分解過(guò)程中發(fā)生的脫氨或脫羧反應(yīng)而引起了總酸含量的波動(dòng)。這種反應(yīng)可能是豆腐變質(zhì)的開(kāi)始。

(a)樣品1～5；(b)樣品6～10；(c)樣品11～15；(d)樣品16～20圖2 儲(chǔ)存時(shí)間與總酸預(yù)測(cè)值關(guān)系散點(diǎn)圖Fig.2 The relationship between storage time and total acid content

3 結(jié)論

本研究采用BP-ANN和PLS方法結(jié)合低場(chǎng)核磁共振建立了總酸的校正模型，并選用BP-ANN方法對(duì)休閑豆干在儲(chǔ)存過(guò)程中總酸的儲(chǔ)存變化進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)總酸的預(yù)測(cè)，BP-ANN校正模型性能好于PLS模型，RMSEC，rc，RMSEP及rp分別為0.979 9，0.032 2，0.978 1和0.037 3。另外，利用BP-ANN模型同時(shí)對(duì)20個(gè)休閑豆干樣品預(yù)測(cè)400 d內(nèi)總酸含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化趨勢(shì),結(jié)果表明，休閑豆干在生產(chǎn)日期之后約7個(gè)月內(nèi)處于總酸含量穩(wěn)定期，從約7個(gè)月開(kāi)始，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，豆干內(nèi)部某些成分可能會(huì)發(fā)生一些物理、生物、化學(xué)反應(yīng)等而使得總酸含量發(fā)生變化。本研究提供了一種快速、準(zhǔn)確、無(wú)損地預(yù)測(cè)休閑豆干中總酸含量，并無(wú)損分析總酸的儲(chǔ)存變化動(dòng)力學(xué)方法，可為休閑豆干質(zhì)量安全性提供一種綜合、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)思路，為完善休閑豆干的質(zhì)量保證和監(jiān)管體系提供了一定的理論和技術(shù)支持。