王譽(yù)博，李子孝，3，4，王擁軍，3，4

在我國(guó)，卒中是居民死亡和成人致殘的首位病因，其中缺血性卒中患者比例超過80%，70%～80%的患者因功能殘疾不能獨(dú)立生活，為我國(guó)的經(jīng)濟(jì)帶來了沉重負(fù)擔(dān)[1]。在缺血性卒中帶來的患者、家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)日益加重的背景下，現(xiàn)有的靜脈溶栓及血管內(nèi)取栓等治療方法，都無法徹底修復(fù)卒中帶來的神經(jīng)功能損傷。缺血性卒中后神經(jīng)功能缺損大多認(rèn)為與局部腦血流量的顯著減少導(dǎo)致氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏并導(dǎo)致細(xì)胞死亡相關(guān)，目前許多研究表明氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮了重要作用[2]。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。缺血性卒中后，在腦缺血/再灌注過程中會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基（氧化劑），引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化性神經(jīng)元死亡，尤其是線粒體功能障礙等[3]。因此，抑制氧化應(yīng)激可能成為缺血性卒中治療的新方向。

表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下基因表達(dá)的可遺傳變化，這些變化包含不同的基因表達(dá)模式[4]。表觀遺傳過程利用廣泛的機(jī)制促進(jìn)染色質(zhì)狀態(tài)的形成和維持，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等[4-7]。除此之外，表觀遺傳過程的特殊在于其是可逆的，其染色質(zhì)的狀態(tài)是動(dòng)態(tài)的，會(huì)根據(jù)局部環(huán)境的變化做出反應(yīng)[4]。綜上，了解表觀遺傳調(diào)控如何影響血管神經(jīng)單元中的氧化應(yīng)激，對(duì)尋找缺血性卒中的特異性治療靶點(diǎn)具有重要意義。

1 DNA甲基化與缺血性卒中后氧化應(yīng)激

DNA甲基化主要是指CpG島胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化過程，通常能夠在不改變DNA序列的前提下，通過轉(zhuǎn)錄抑制來調(diào)節(jié)全局和特異性基因表達(dá)，是最早被發(fā)現(xiàn)和研究最廣泛的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一[8]。在一項(xiàng)利用表觀基因組全關(guān)聯(lián)研究方法（epigenome-wide association studies，EWAS）評(píng)估DNA甲基化與缺血性卒中關(guān)系的研究中，研究者使用Infinium 450K和EPIC BeadChip在一個(gè)隊(duì)列（252例缺血性卒中患者和43位正常者）中評(píng)估了差異甲基化位置（differentially methylated positions，DMPs）和差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs），在另一個(gè)隊(duì)列（618例缺血性卒中患者和243位正常者）中評(píng)估了重復(fù)的DMPs和卒中亞型之間的關(guān)系，使用EpiDISH在相關(guān)CpG位點(diǎn)上分析了差異甲基化細(xì)胞類型（differentially methylated cell-type，DMCT），最終，使用孟德爾隨機(jī)化方法對(duì)相關(guān)CpG位點(diǎn)進(jìn)行了通路富集分析和因果關(guān)系分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有重復(fù)的DMPs都與心源性、動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成和不明原因的卒中風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)；DMCT分析表明，自然殺傷細(xì)胞在其中發(fā)揮了重要作用；通路富集分析顯示氧化應(yīng)激等特定途徑基因過表達(dá)[9]。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMT）是介導(dǎo)DNA甲基化的重要因素，包括DNMT3A和DNMT3B（從頭甲基化）以及DNMT1（維持甲基化）[10]。缺血性卒中后導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）/活性氮（reactive nitrogen species，RNS），ROS/RNS可直接對(duì)胞嘧啶進(jìn)行化學(xué)修飾，將5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC），抑制DNMT1和甲基化CpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MBP）結(jié)合到DNA，改變甲基化模式[11]。此外，過氧化物還會(huì)引起核堿基修飾，如5-氯胞嘧啶可模擬5-mC并在CpG序列中誘導(dǎo)不正確的DNMT1甲基化，導(dǎo)致基因沉默。這些研究均證明缺血性卒中后氧化應(yīng)激和表觀遺傳調(diào)控之間存在聯(lián)系[12-13]。

Hcy代謝對(duì)于DNA甲基化至關(guān)重要，是表觀遺傳調(diào)控機(jī)制中的關(guān)鍵途徑。Hcy水平升高已被認(rèn)為是缺血性卒中的危險(xiǎn)因素[14-15]。Hcy代謝受損常引起血漿中Hcy濃度升高（高同型半胱氨酸血癥），導(dǎo)致氧化還原失衡和氧化應(yīng)激增加[16]，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，進(jìn)而引發(fā)各種心腦血管事件，主要包括缺血性心臟病和缺血性卒中[17]。

除此之外，缺血性卒中后氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞整體DNA甲基化水平升高，而DNMT抑制劑可以減輕缺血后氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)損傷[18]。例如，5-Aza-脫氧胞苷（5-Azadeoxycytidine，5-Aza-dC）通過抑制DNA甲基化縮小了大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型小鼠的腦梗死體積，具有神經(jīng)保護(hù)作用，這可能與缺血后神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)有關(guān)，但其中的具體機(jī)制仍不明確[19]。同時(shí)，也有研究者有不同的發(fā)現(xiàn)：在一項(xiàng)關(guān)于血液DNA甲基化和缺血性卒中的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)缺血性卒中患者普遍存在血液長(zhǎng)散布核元件-1（long interspersed nuclear elements-1，LINE-1）的低甲基化，同時(shí)縱向分析顯示，LINE-1甲基化水平較低的人發(fā)生缺血性心臟病和缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)較高且總死亡率較高[20]。

綜上所述，DNA甲基化和缺血性卒中后氧化應(yīng)激存在顯著的聯(lián)系，但其中所涉及的具體表觀遺傳機(jī)制仍有待更深入的研究。

2 組蛋白修飾和缺血性卒中后氧化應(yīng)激

越來越多的研究表明組蛋白修飾在心腦血管發(fā)育、骨骼形成等多種生物學(xué)過程中扮演著重要的角色，尤其在調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的生命周期中具有重要地位[21-22]。細(xì)胞內(nèi)組蛋白包裹DNA形成核小體，多種組蛋白修飾酶可改變DNA構(gòu)象，導(dǎo)致核小體重新定位，進(jìn)而激活或抑制轉(zhuǎn)錄。組蛋白修飾包括乙?；?去乙酰化、甲基化/去甲基化和磷酸化等。研究者發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾酶的調(diào)節(jié)在缺血性卒中中有重要作用。

2.1 組蛋白乙酰化/去乙?；?組蛋白乙酰化/去乙?；且粋€(gè)重要的翻譯后修飾，其所引起的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑是表觀遺傳調(diào)控的重要機(jī)制[23]。組蛋白乙?；?去乙酰化與轉(zhuǎn)錄激活/抑制有關(guān)，并分別被兩個(gè)作用相反的酶調(diào)控，即組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HATs）和組蛋白去乙酰酶（histone deacetyltransferase，HDACs）[24]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明HDACs在缺血性卒中過程中發(fā)揮作用，多種HDACs的表達(dá)水平隨著時(shí)間的推移而發(fā)生不同的改變：急性腦缺血后HDAC1和HDAC2表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性下降；HDAC5的表達(dá)水平在再灌注3 h后呈時(shí)間依賴性下降；HDAC6和HDAC11的表達(dá)水平在再灌注3 h內(nèi)升高，但隨著時(shí)間的推移，其表達(dá)水平也開始下降[25-26]。一項(xiàng)針對(duì)缺血性卒中及其亞型的歐洲人群全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)，編碼HDACs蛋白的HDAC9基因變異可導(dǎo)致卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著升高[27]。

過氧化物酶是神經(jīng)保護(hù)性抗氧化酶，可保護(hù)神經(jīng)元免受卒中后氧化應(yīng)激失衡造成的損傷。然而，其活性位點(diǎn)半胱氨酸在卒中后因過氧化而失活，失去對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。神經(jīng)突觸活性（synaptic activity）可以促進(jìn)神經(jīng)元中過度氧化的過氧化物酶（hyperoxidized peroxiredoxins）減少，并誘導(dǎo)硫氧還蛋白（Srxn1）和sestrin 2蛋白（Sesn2）的表達(dá)。研究顯示sestrin 2蛋白啟動(dòng)子通過活性依賴性組蛋白乙酰化激活轉(zhuǎn)錄。通過用組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）處理神經(jīng)元增強(qiáng)組蛋白乙酰化，可以誘導(dǎo)sestrin 2蛋白和硫氧還蛋白的表達(dá)[28]。同時(shí)，保護(hù)劑量的TSA可減少因氧化應(yīng)激而損傷的神經(jīng)元中過氧化的過氧化物酶的生成[28]。

除此之外，在小鼠缺血性卒中模型中發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注3 h，HDAC3、HDAC6和HDAC11的表達(dá)顯著增加，而使用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）選擇性抑制HDAC3或HDAC6，顯著改善了氧化應(yīng)激后皮質(zhì)神經(jīng)元的存活情況，提示缺血性卒中后干預(yù)特定HDAC亞型表達(dá)可能成為新的治療方法[26]。研究者在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞在氧-葡萄糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）60 min后，HDAC1、HDAC2、HDAC3表達(dá)水平上調(diào)，其中HDAC3表達(dá)水平上調(diào)幅度最大[29]。也有研究表明HDAC4和HDAC5表達(dá)水平在腦缺血/再灌注損傷和OGD模型中均顯著降低，NADPH氧化酶介導(dǎo)的HDAC4和HDAC5表達(dá)通過高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein 1，HMGB1）信號(hào)通路導(dǎo)致腦缺血損傷，因此抑制NADPH氧化酶活性可改善腦缺血/再灌注損傷[30]。這些都表明了HDAC的不同亞型在卒中后氧化應(yīng)激中發(fā)揮不同的作用并參與卒中后氧化應(yīng)激的進(jìn)程。

研究者在缺血性卒中小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)泛HDAC抑制不僅保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激，并通過促進(jìn)熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）等神經(jīng)保護(hù)因子的表達(dá)增加起到一定的治療作用[31]。但HDAC抑制劑對(duì)多種中樞神經(jīng)細(xì)胞的毒性，阻礙了其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用。最近有研究表明，神經(jīng)元損傷導(dǎo)致HDAC6表達(dá)增加，而抑制HDAC6則可以促進(jìn)神經(jīng)元的存活和再生，選擇性抑制HDAC6避免了與泛HDAC抑制相關(guān)的細(xì)胞死亡[32]。因此，HDAC6可能成為一種潛在的無毒治療靶點(diǎn)，用于改善以氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)變性和軸突再生不足為特征的包括缺血性卒中在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[32]。

綜上所述，雖然已有部分研究證明了組蛋白乙酰化/去乙?；c缺血性卒中后氧化應(yīng)激的關(guān)系，但其特定亞型和具體機(jī)制仍不清楚，闡明特定HDAC在大腦中的作用以及開發(fā)特異性的治療策略治療卒中可能會(huì)帶來更有益的結(jié)局。

2.2 組蛋白的其他修飾 除了組蛋白乙酰化/去乙?；?，組蛋白修飾還包括組蛋白甲基化/去甲基化、組蛋白磷酸化和組蛋白泛素化等。同組蛋白乙?；?去乙?；粯?，其他組蛋白修飾方式在卒中后氧化應(yīng)激中的作用機(jī)制也未明確。

隨著組蛋白去甲基化酶（histone demethylase，HDM）的發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)組蛋白甲基化的了解也變得更多[33]。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了越來越多的組蛋白甲基化酶（histone methylase，HMT）和HDM，但組蛋白甲基化在卒中后的作用仍然不明。在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究者發(fā)現(xiàn)與年輕雌性小鼠相比，年老雌性小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的組蛋白3的四位賴氨酸（histone H3 at lysine 4，H3K4）甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低，缺血性梗死體積增大[34]。通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation，ChIP-seq），研究者發(fā)現(xiàn)與年老雌性小鼠相比，年輕雌性小鼠在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的組蛋白第三亞基四號(hào)賴氨酸的三甲基化（trimethylation of lysine 4 on histone H3 protein subunit，H3K4me3，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子）富集的峰增多，而組蛋白第三亞基九號(hào)賴氨酸的三甲基化（trimethylation of lysine 9 on histone H3 protein subunit，H3K9me3，轉(zhuǎn)錄抑制子）富集的峰減少，表明缺血后年老雌性小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中染色質(zhì)活性較低[34]。通過H3K4me3富集基因的DAVID聚類分析，研究者將250個(gè)基因富集在7個(gè)簇中，基因富集最多的簇基因本體論（gene ontology，GO）分析注釋結(jié)果為“細(xì)胞運(yùn)動(dòng)”，其他簇為“細(xì)胞繁殖、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、DNA損傷、離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和磷酸化調(diào)節(jié)”，同時(shí)，京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)上調(diào)，VEGF是一種血管生成因子，可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞遷移，在腦缺血后神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞保護(hù)和恢復(fù)中起著重要作用[34]。這些數(shù)據(jù)表明隨著年齡的增長(zhǎng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的染色質(zhì)活性降低，加強(qiáng)了對(duì)衰老相關(guān)卒中嚴(yán)重程度差異的可能機(jī)制的見解。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）是一種染色質(zhì)修飾酶，可特異性去除H3K4上的甲基并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制，這是表觀遺傳轉(zhuǎn)錄激活的特定標(biāo)簽之一。研究表明腦缺血再灌注損傷后，LSD1的表達(dá)在時(shí)間和空間上發(fā)生變化，表明LSD1可能參與卒中后的神經(jīng)再生[35]。同時(shí)，LSD1是一種黃素依賴性胺氧化酶，其可以刺激雄激素受體依賴性轉(zhuǎn)錄，將氧氣轉(zhuǎn)化為過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）[36]。因此，LSD1參與氧化反應(yīng)，其在卒中后氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)中的作用值得更深入的研究。

除了組蛋白甲基化和乙酰化外，在腦缺血后也會(huì)發(fā)生組蛋白磷酸化。研究表明離子型谷氨酸受體的過度激活會(huì)增強(qiáng)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致缺血和癲癇等神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元死亡，而組蛋白翻譯后修飾可能是檢測(cè)和修復(fù)氧化應(yīng)激損傷（包括DNA損傷）的關(guān)鍵方式，因此可能會(huì)影響以過度釋放谷氨酸為特征的損傷后的神經(jīng)元存活[37]。缺血后過度活躍的谷氨酸受體增加了氧化應(yīng)激并誘發(fā)了神經(jīng)元中的磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）增多，γ-H2AX隨著卒中進(jìn)展而積累，但這種情況可以通過抗氧化劑預(yù)處理得到改善[37]。IκB激酶（inhibitor of kappa B kinase，IKK）復(fù)合物是核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路經(jīng)典激活的核心成分，研究發(fā)現(xiàn)在銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase，SOD1）敲除小鼠中，短暫性局灶性腦缺血后，NF-κB誘導(dǎo)激酶（NF-κB inducing kinase，NIK）（IKKα的上游激酶）、磷酸化IKKα（phosphorylation of IKKα，pIKKα）和磷酸化組蛋白H3（phosphorylation of histone H3，pH3）（Ser10）水平增加[38]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OGD誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞中pH3增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。用IKKα小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）治療可顯著減少 OGD后的細(xì)胞死亡。這些結(jié)果表明，氧化應(yīng)激相關(guān)的NIK、IKKα和pH3的增加與腦缺血后的細(xì)胞死亡有關(guān)[38]。

綜上所述，不同類型的組蛋白修飾在缺血性卒中后氧化應(yīng)激中都發(fā)揮著重要但不確切的作用，需要進(jìn)一步闡明。

3 非編碼RNA與缺血性卒中后氧化應(yīng)激

功能性非編碼RNA在基因表達(dá)中發(fā)揮著重要作用，可分為長(zhǎng)鏈非編碼RNA和短鏈非編碼RNA，其中，短鏈非編碼RNA中的微小RNA（microRNA，miRNA/miR）與多種卒中危險(xiǎn)因素有關(guān)，包括動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等[39-40]。miRNA是大約22個(gè)核苷酸的小RNA分子，在基因組水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控。研究表明，miR-424可縮小缺血/再灌注后的梗死體積并抑制神經(jīng)元凋亡，降低皮質(zhì)中的ROS和丙二醛水平，總體來說miR-424通過抑制氧化應(yīng)激來預(yù)防短暫性腦缺血/再灌注損傷[41]。miR-210是一種受缺氧誘導(dǎo)因子和Akt激酶依賴性途徑調(diào)節(jié)的重要miRNA，研究表明其表達(dá)增加與迷走神經(jīng)刺激調(diào)節(jié)腦缺血/再灌注的氧化還原狀態(tài)有關(guān)，是針對(duì)腦缺血/再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)的潛在靶點(diǎn)[42]。在小鼠中，miR-137通過抑制Src依賴性MAPK信號(hào)通路減弱氧化應(yīng)激、凋亡和炎癥通路，從而對(duì)缺血性卒中產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[43]。腦組織中最豐富的miRNA為miR-124，研究表明miR-124在腦缺血后的外周血和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-124可通過激活PI3K/AKT/Nrf2通路增加熱休克蛋白表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來保護(hù)小鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株（pheochromocytoma-12，PC-12）免受糖氧剝奪離體腦缺血/再灌注誘導(dǎo)的損傷[44]。

miRNA在缺血性卒中病理生理機(jī)制中的作用成為近年來的研究熱點(diǎn)之一，除去單純的機(jī)制研究，未來利用miRNA進(jìn)行靶向治療也可能成為新的探索方向。

缺血性卒中后腦損傷包括卒中后炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂、血腦屏障破壞等導(dǎo)致的細(xì)胞死亡和神經(jīng)功能缺損等。近年來，氧化應(yīng)激反應(yīng)在缺血性卒中后腦損傷中的作用越來越受到人們的關(guān)注。大量研究證實(shí)卒中后氧化應(yīng)激與表觀遺傳機(jī)制之間存在緊密聯(lián)系，但其中的機(jī)制是復(fù)雜且不清的，需要更深入的研究探索表觀遺傳機(jī)制在卒中后氧化應(yīng)激中的具體作用。基于此，未來通過干預(yù)表觀遺傳調(diào)控，改善卒中后氧化應(yīng)激失衡帶來的腦損傷，可能成為缺血性卒中治療的新方向。