魯莎 譚從娥

右歸丸源自于中醫(yī)經(jīng)典《景岳全書》中的補(bǔ)腎名方，以“益火之源”培右腎元陽為制方根本，以“陰中求陽”為立方理論[1]。該方由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當(dāng)歸、肉桂、制附子十味中藥組成，方中肉桂、附子與鹿角膠合用溫補(bǔ)腎陽、填精益髓，熟地黃、山茱萸、山藥、菟絲子、枸杞子、杜仲合用滋腎陰、補(bǔ)肝脾，當(dāng)歸養(yǎng)肝補(bǔ)血，十藥合用溫補(bǔ)腎陽，補(bǔ)血填精[2]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)右歸丸具有調(diào)節(jié)免疫功能、骨代謝、神經(jīng)系統(tǒng)等多方面作用，在臨床上治療膝骨關(guān)節(jié)炎、卵巢早衰、骨質(zhì)疏松等疾病效果顯著[3]。右歸丸的臨床療效雖已得到證實(shí)，然其療效機(jī)制目前仍未完全闡明。信號通路是細(xì)胞信息傳遞及其功能發(fā)揮的基本途徑，研究證明右歸丸可能通過調(diào)控某些特定功能的分子通路而發(fā)揮治療作用。因此，本文對近年來右歸丸具有調(diào)控作用的主要分子信號通路進(jìn)行綜述。

1 核轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)通路

核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)是在B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子，因?yàn)樗c免疫球蛋白κ輕鏈的增強(qiáng)子B序列特異性結(jié)合并促進(jìn)表達(dá)而得名。NF-κB通常與抑制蛋白IKB結(jié)合成三聚體復(fù)合物，存在于未受刺激的細(xì)胞質(zhì)中，可以迅速釋放進(jìn)人細(xì)胞核而不需要重新合成蛋白。該轉(zhuǎn)錄因子由Rel蛋白家族不同成員組成，如p65蛋白 (RelA)、p50蛋白、p52蛋白、c-Rel蛋白和RelB蛋白等，可激活參與應(yīng)激反應(yīng)、炎癥和程序性細(xì)胞死亡(凋亡)的多種基因。NF-κB/IKB復(fù)合體被磷酸化和泛素化后，NF-κB暴露出其核定位序列并從細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)入到細(xì)胞核中，與核內(nèi)DNA上的特異性序列相結(jié)合，繼而啟動或增強(qiáng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[4]。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子控制著影響免疫反應(yīng)的基因表達(dá)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，右歸丸對腎陽虛證的調(diào)控與NF-κB信號通路相關(guān)。譚從娥等[6]研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛證引起的免疫紊亂狀態(tài)患者服用右歸丸治療后，其在Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)介導(dǎo)的髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/NF-κB信號通路中，MyD88,NF-κB的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，證明右歸丸通過該通路糾正腎陽虛證免疫紊亂狀態(tài)。

NF-κB通路同時(shí)也是一種促炎通路，主要基于NF-κB在促炎基因表達(dá)中的作用，包括細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子[7]。白細(xì)胞介素-6(interleukin-6 ，IL-6)和基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)在磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases B,PKB/Akt)/NF-κB信號通路中可能作為該通路的下游調(diào)控分子，與炎癥反應(yīng)有關(guān)[8]。動物實(shí)驗(yàn)表明，右歸丸可抑制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為降低PI3K/Akt/NF-κB信號通路中的PI3K和pAkt及MMP-14蛋白和IL-6的表達(dá)，從而改善膝骨關(guān)節(jié)炎病變[9]。右歸丸還可通過干預(yù)NF-κB/SREBPs通路減少炎癥因子釋放，表現(xiàn)為抑制血清中白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的炎性因子含量，使主動脈組織 TLR4、NF-κB p65、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)-1c和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)mRNA的表達(dá)下降[10]。此外，在右歸丸含藥血清干預(yù)經(jīng)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞(THP-1)源性泡沫細(xì)胞制備的高膽固醇模型中，發(fā)現(xiàn)右歸丸可能通過抑制NF-κB通路中NF-κB 、p65和SREBP-1c的表達(dá)調(diào)節(jié)血脂，并且通過降低炎癥因子的釋放預(yù)防動脈粥樣硬化[11]。

上述研究表明右歸丸通過增強(qiáng)NF-κB通路免疫基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控腎陽虛證免疫功能，抑制該通路的促炎基因表達(dá)減少炎癥因子釋放緩解炎癥反應(yīng)。表明右歸丸在NF-κB通路存在雙向調(diào)節(jié)作用，且在緩解炎癥反應(yīng)方面是通過多條通道發(fā)揮療效，展現(xiàn)了右歸丸多靶點(diǎn)、多通道的特點(diǎn)，提示右歸丸可能對NF-κB通路相關(guān)免疫類、炎癥類的疾病發(fā)揮治療作用。

2 WNT/β-Catenin經(jīng)典信號通路

WNT是一類高度不溶蛋白，其通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合繼而引發(fā)下游一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。WNT通路分為β-Catenin蛋白依賴性經(jīng)典通路和非依賴性通路(本文主要介紹經(jīng)典通路)[12]。該通路控制著大量與生長和代謝相關(guān)的基因表達(dá)，同時(shí)，WNT通路與小腸組織穩(wěn)定性、毛囊發(fā)生、骨密度、造血干細(xì)胞分化等生理功能有密切關(guān)系[13]。

在WNT/β-Catenin經(jīng)典通路中，WNT蛋白與受體結(jié)合，膜上信號通過Dsh蛋白解體APC蛋白，β-Catenin的濃度不斷升高，進(jìn)入細(xì)胞核，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄[14]。經(jīng)典的 WNT/β-Catenin通路被認(rèn)為與成骨細(xì)胞的形成有關(guān)[13]，成骨細(xì)胞功能下降是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要病理基礎(chǔ)[15]。近年研究發(fā)現(xiàn)，右歸丸通過干預(yù)WNT/β-Catenin通路提高成骨細(xì)胞功能達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的作用。如章建華[16]等對腎陽虛證骨質(zhì)疏松癥大鼠服用右歸丸藥液，發(fā)現(xiàn)右歸丸含藥血清組相較空白血清組可增強(qiáng)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、WNT/β-catenin信號通路相關(guān)因子β-catenin、ERK1蛋白、ERK2蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖；李玲慧等[17]研究發(fā)現(xiàn)右歸丸可以使糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3β)表達(dá)水平降低、β-Catenin表達(dá)水平升高，激活WNT/β-Catenin通路，提高成骨細(xì)胞分泌ALP蛋白的能力；付小衛(wèi)等[18]研究表明右歸丸可以激活WNT/β-Catenin通路調(diào)控成骨細(xì)胞發(fā)育、分化和增值。但目前對右歸丸干預(yù)WNT/β-Catenin通路治療骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮的作用認(rèn)識尚淺，與之相關(guān)的具體下游機(jī)制尚未闡明，今后需加強(qiáng)WNT/β-Catenin通路的右歸丸基礎(chǔ)和臨床研究。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)WNT經(jīng)典通路異常激活有可能是導(dǎo)致膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜損傷、軟骨破壞的主要原因，而右歸丸可以抑制WNT經(jīng)典通路中的WNT1-誘導(dǎo)信號通路蛋白-1 (WNT1-inducible signaling pathway protein 1,WISP1)、WNT1、β-catenin和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein5，LRP5)mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá)從而緩解減輕膝骨關(guān)節(jié)炎的病變[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，WNT/β-Catenin通路具有抗炎和促炎功能，該功能是由于抑制或增強(qiáng)NF-κB通路[20]。研究人員在膝骨關(guān)節(jié)炎模型鼠軟骨組織中發(fā)現(xiàn)信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)和IL-6表達(dá)明顯上升，經(jīng)右歸丸干預(yù)后STAT3和IL-6的表達(dá)明顯降低[21]。而IL-6為NF-κB的下游調(diào)控分子并與炎癥反應(yīng)有關(guān)[8]。本篇第一節(jié)已詳細(xì)闡述右歸丸通過干預(yù)NF-κB通路減少炎癥反應(yīng)，結(jié)合上述兩項(xiàng)研究表明右歸丸治療膝骨關(guān)節(jié)炎是通過WNT/β-Catenin通路和NF-κB通路共同發(fā)揮作用，但二者的關(guān)聯(lián)研究目前尚無進(jìn)展。

3 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相關(guān)通路

3.1 絲裂原活化蛋白激酶信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一類能被不同細(xì)胞外信號如神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、激素等刺激的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK的激活是以三級激酶的形式進(jìn)行，MAPKKK、MAPkk、和MAPK依次磷酸化激活，MAPK進(jìn)而進(jìn)入核內(nèi)參與介導(dǎo)細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂和分化等多種生理病理過程[22]。 JNK蛋白和P38蛋白同屬于MAPK家族，但來自于不同的激活途徑，JNK/P38通路與許多病理?xiàng)l件相關(guān)，包括癌癥、中風(fēng)和炎癥性疾病等，所以抑制JNK/P38的藥物可能對治療有積極作用[23]。近年研究中發(fā)現(xiàn)，右歸丸對于MAPK通路的調(diào)控存在雙向調(diào)節(jié)的作用，并且主要集中在JNK/P38途徑。NADPH氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)是腎臟活性氧(reactive oxygen species,ROS)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，受NOX4調(diào)控的ROS、P38/MAPK在激素抵抗型腎病綜合征(steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS)患者腎小球中的表達(dá)水平較高[24]。王新斌[25]等建立SRNS大鼠給予右歸丸治療發(fā)現(xiàn)大鼠腎組織中JNK、P38蛋白磷酸化水平明顯降低，而模型組大鼠腎組織的JNK、P38蛋白磷酸化水平明顯升高，提示右歸丸通過抑制JNK/P38信號通路達(dá)到治療SRNS作用。此外，在對右歸丸干預(yù)慢性腎功能大鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，右歸丸可降低P38磷酸化水平，抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)腎功能；同時(shí)可使MAPkk磷酸化水平升高，激活迷走神經(jīng)，使交感神經(jīng)活性相對降低繼而抑制左心室肥厚[26]。綜上右歸丸在MAPK通路中的雙向調(diào)節(jié)作用可能是由于增強(qiáng)或抑制MAPK家族不同亞族，并為JNK/P38途徑相關(guān)的疾病治療提供新選擇，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.2 雷帕霉素靶蛋白信號通路

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于P13K激酶家族，參與mTORC1和mTORC2兩種多亞基蛋白復(fù)合物。mTOR是該通路的重要細(xì)胞信號中樞，其上游有多條通路匯聚到mTOR調(diào)控下游分子，包括生長控制、蛋白質(zhì)合成、基因表達(dá)和代謝平衡[27-28]。收集近年文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)右歸丸干預(yù)mTOR通路主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是激活mTOR蛋白發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)和促進(jìn)成骨細(xì)胞形成；二是抑制mTOR蛋白治療慢性關(guān)節(jié)退行性疾病。孕酮是mTOR通路在海馬體的重要調(diào)節(jié)因子[29]，而抑郁癥與海馬體的減少有關(guān)[30]。研究發(fā)現(xiàn)通過對抑郁模型大鼠海馬腦區(qū)自噬水平觀察、選用糖水偏好率作為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)右歸丸給藥組的糖水偏好率較模型組顯著升高且海馬CA3區(qū)LC3蛋白免疫熒光強(qiáng)度較模型組減弱[31]。這是由于右歸丸可以增強(qiáng)AKT、mTOR1蛋白磷酸化水平激活mTOR通路，從而對抑郁癥模型大鼠發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)有積極作用[32]。另有研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPactivated proteinkinase，AMPK)/mTOR信號通路中AMPK蛋白異常激活導(dǎo)致mTOR蛋白異常抑制，是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠的機(jī)制之一；右歸丸通過減少AMPKα基因與磷酸化的p-AMPKα蛋白表達(dá)、增加mTOR基因和磷酸化的p-mTOR蛋白表達(dá)干預(yù)AMPK/mTOR信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞形成[33-34]。此外，骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性關(guān)節(jié)退行性疾病，其特征是關(guān)節(jié)破壞和關(guān)節(jié)炎癥[35]。IL-1β是促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨降解的主要炎癥細(xì)胞因子，IL-1β的產(chǎn)生是通過P13/AKT/mTOR通路的激活[36]。研究表明右歸丸治療慢性關(guān)節(jié)退行性疾病是通過抑制該通路P13K、AKT、mTOR的蛋白磷酸化水平表達(dá)[37]。

4 轉(zhuǎn)化生長因子-β相關(guān)通路

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGf-β)是TGF蛋白家族中的一員，它是一種雙功能調(diào)節(jié)因子，既可以刺激細(xì)胞增殖，也可以抑制細(xì)胞增殖[38]。并且TGF-β是一個(gè)細(xì)胞因子超家族，包括TGF-(β1、β2,和β3)、激活素、抑制素、抗髓質(zhì)激素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長分化因子、結(jié)節(jié)和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，TGF-β信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡、血管生成和免疫反應(yīng)等重要細(xì)胞活動中發(fā)揮重要作用[39-40]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要分化方向?yàn)槌晒羌?xì)胞和脂肪細(xì)胞，但骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞會隨著年齡的增長而逐漸老化，導(dǎo)致成骨細(xì)胞生成減少[41]，而TGF家族中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白是成骨細(xì)胞形成所必須的信號[42]。有研究表明右歸丸含藥血清可以上調(diào)TGF-β通路中的TGF-β、BMP-7、血清骨鈣素的蛋白濃度，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，對于骨質(zhì)疏松癥的防治有積極意義[43]。另有實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明右歸丸通過TGF-β1/Smad2/3/4通路促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化[44-45]。

5 分析與展望

綜上，右歸丸通過調(diào)控NF-κB信號通路、WNT/β-Catenin經(jīng)典信號通路、MAPK信號通路、mTOR信號通路和TGF-β信號通路發(fā)揮治療作用，這些成果有助于解釋右歸丸的療效機(jī)制，也為臨床應(yīng)用提供更多的參考。但筆者也發(fā)現(xiàn)，目前右歸丸調(diào)控信號通路的基礎(chǔ)研究較少，并且右歸丸藥物成分十分復(fù)雜，治療靶點(diǎn)多、途徑多。近年來，生物信息學(xué)的分析方法和高通量檢測技術(shù)已應(yīng)用于中醫(yī)藥復(fù)雜問題的研究中，可為明確右歸丸的靶點(diǎn)提供依據(jù)，有助于更深入地研究右歸丸發(fā)揮療效的具體途徑。此外，進(jìn)一步深入研究右歸丸的作用機(jī)制，將有助于擴(kuò)大右歸丸臨床使用范圍。