王 勉，楊建民，宋志強(qiáng)，唐古生

（海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科實驗室，上海 200433）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病（central nervous system leukemia，CNSL）是白血病細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的直接浸潤，中樞神經(jīng)是白血病髓外受累最常見的部位，有研究發(fā)現(xiàn)，約26%的成人初發(fā)急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者和21%的初發(fā)急性非淋巴細(xì)胞白血病患者會表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累[1]。近半個多世紀(jì)以來，傳統(tǒng)化療方案的改進(jìn)和各種靶向藥物的應(yīng)用，使白血病治療的緩解率得到了顯著提高，但仍有許多白血病患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，合并CNSL是最重要的原因，預(yù)后往往較差[2-3]。初診CNSL患者復(fù)發(fā)率也較高，約占復(fù)發(fā)患者的20%～30%，占兒童復(fù)發(fā)ALL的30%～40%，是復(fù)發(fā)難治的主要原因[2-3]，CNSL患者需要更強(qiáng)的、靶向中樞的治療措施[2]，早期診斷和治療CNSL，對于預(yù)防白血病復(fù)發(fā)、提高患者生存率具有重要意義。

目前，CNSL的診斷主要依賴于實驗室檢查和/或臨床癥狀。但總體而言，目前的實驗室檢測無法較好地早期診斷CNSL。本文對腦脊液常規(guī)檢查（腦脊液壓力、細(xì)胞學(xué)涂片和生化指標(biāo)檢測）、流式細(xì)胞免疫分型等CNSL實驗室輔助診斷方法和單個蛋白、核酸等標(biāo)志物，以及各種組學(xué)標(biāo)志的研究進(jìn)展和臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 常規(guī)腦脊液細(xì)胞學(xué)和生化指標(biāo)檢測

目前，診斷CNSL的金標(biāo)準(zhǔn)是腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，但結(jié)果易受樣本采集、制片、主觀判讀等因素影響，靈敏度低，特別是容易漏診細(xì)胞較少的樣本，單次腦脊液形態(tài)學(xué)檢查的敏感性<50%[2]。基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測數(shù)據(jù)顯示，成人ALL初診時僅有5%～10%伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累[2]，兒童則有8.0%～13.4%[2-4]。10%～35%的腦脊液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查未查見腫瘤細(xì)胞的白血病患者，后續(xù)仍會出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累[5]。另外，有60%的CNSL患者沒有顱神經(jīng)麻痹癥狀和細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)[6-7]，因此需要更靈敏的方法來確認(rèn)腦脊液中白血病細(xì)胞浸潤情況。腦脊液壓力和生化指標(biāo)異常，對于臨床癥狀不明顯或處于疾病早期的病例，常會有提示作用。常用指標(biāo)包括：總蛋白質(zhì)、糖和氯化物定量。CNSL患者腦脊液蛋白質(zhì)的含量會明顯增多，主要與病變時血腦屏障通透性發(fā)生改變，外周血蛋白質(zhì)進(jìn)入腦脊液相關(guān)；而糖定量明顯減少是由其分解增多所導(dǎo)致的[8]。但這些指標(biāo)均不具有特異性，僅能輔助診斷CNSL。

腦脊液乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和β2-微球蛋白（beta2-microglobulin，β2-MG）也常被臨床用來輔助判斷CNSL。正常情況下，腦脊液LDH活性很低，約為血清中的 1/10，發(fā)生CNSL時，白血病細(xì)胞浸潤到腦膜和腦實質(zhì)，使腦脊液LDH活性升高，與其他方式聯(lián)用可提高CNSL的診斷率[9]。正常腦脊液中的β2-MG含量很少，CNSL時白血病細(xì)胞無限增殖，腫瘤抗原致敏淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞，使其大量合成β2-MG。王文靜等[10]發(fā)現(xiàn)，CNSL患者腦脊液中β2-MG水平明顯高于非CNSL患者，單指標(biāo)陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為70.76%和68.01%，敏感性和特異性分別為67.34%和72.34%。因此，白血病患者腦脊液β2-MG水平升高可提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤浸潤可能。然而，腦脊液常規(guī)、LDH和β2-MG等指標(biāo)的檢測結(jié)果受炎癥、感染、出血等多種因素的影響，臨床上也常見腦脊液壓力和/或蛋白升高或生化指標(biāo)異常，但疾病進(jìn)程中始終未見CNSL臨床表現(xiàn)的患者。因此，腦脊液常規(guī)生化指標(biāo)檢測診斷CNSL的特異性、敏感性仍遠(yuǎn)不能滿足需求。

2 腦脊液多參數(shù)流式細(xì)胞（multi-parameter flow cytometry，MFC）免疫分型

腦脊液MFC免疫分型較細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查具有分析速度快、收集細(xì)胞數(shù)量多和敏感性高（>0.01%）、特異性好等優(yōu)點[3，5]，可以更加敏感地預(yù)測CNSL的發(fā)生[11]，是目前臨床診斷CNSL的重要方法，極大提高了CNSL的確診率[12]。

對于檢測CNSL患者腦脊液白血病細(xì)胞免疫表型的抗體組合策略，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。通常是各實驗室根據(jù)不同類型CNSL患者白血病細(xì)胞初發(fā)免疫表型（leukemia-associated immunophenotype，LAIP）輔以正常發(fā)育分化過程中特異性的系列標(biāo)志，依據(jù)實驗室流式細(xì)胞儀多色通道的數(shù)量，組成各實驗室特定的多色抗體組合?；镜呐袛喾椒ㄊ怯^察腦脊液有核細(xì)胞中是否有LAIP，或者表型特點不同于正常分化發(fā)育過程中各系列細(xì)胞（different from normal，DFN）的異常細(xì)胞。由于腦脊液細(xì)胞數(shù)少，通常僅組成單管或2管多色抗體組合，常用的抗體可參考《多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測急性白血病及漿細(xì)胞腫瘤微小殘留病中國專家共識（2017版）》[13]。HEGDE等[5]采用MFC在51例侵襲性淋巴瘤患者腦脊液中檢出11例（22%）陽性，而細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查僅檢出1例陽性。最新數(shù)據(jù)表明，采用MFC和/或細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法檢測腦脊液診斷初診成人ALL伴CNSL陽性率可達(dá)25%，兒童初診時伴CNSL陽性率為29.0%～34.5%，遠(yuǎn)高于單用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法[2，14]，MFC聯(lián)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查腦脊液，可明顯提高CNSL的診斷率[15]。與細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查陽性的患者相比，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查陰性但MFC陽性患者腦脊液細(xì)胞計數(shù)和腫瘤細(xì)胞百分比較低，且大多患者無癥狀[16]。我們在臨床工作中采用MFC技術(shù)也多次先于臨床和細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)白血病/淋巴瘤細(xì)胞中樞浸潤。流式細(xì)胞術(shù)高度敏感，能夠在細(xì)胞計數(shù)非常低的樣本中準(zhǔn)確檢出惡性腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而較早地發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，提示臨床進(jìn)行早期干預(yù)。但是，MFC方法學(xué)對技術(shù)人員血液病理論知識、實驗操作及數(shù)據(jù)分析、樣本的即時性等要求比較高。因為中樞浸潤腫瘤細(xì)胞的免疫表型可能發(fā)生改變，引起MFC的漏檢，所以當(dāng)MFC陰性而細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查陽性時，并不能排除CNSL，需要臨床醫(yī)生和檢測人員綜合評估、仔細(xì)評判。

3 蛋白質(zhì)水平的標(biāo)志物

在疾病發(fā)展過程中，白血病細(xì)胞向腦組織遷移并與血腦屏障結(jié)合，通過分泌多種細(xì)胞因子、生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）破壞細(xì)胞外基質(zhì)和管腔緊密連接蛋白，從而破壞血腦屏障，并協(xié)助形成致瘤的局部微環(huán)境[17]。在這一過程中，各種蛋白均可能在腦脊液中出現(xiàn)，并可作為潛在的CNSL的標(biāo)志物。

MMP是細(xì)胞外微環(huán)境主要的調(diào)節(jié)因子，與基底膜破壞有關(guān)，與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）共同促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18]。在惡性膠質(zhì)瘤中，腦脊液MMP-9可能是早期檢測腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志，在血液系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的是MMP-2和MMP-9，主要降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原蛋白[19]。有學(xué)者比較了67例白血病患者（CNSL患者29例）腦脊液中的MMP表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CNSL患者M(jìn)MP-2水平明顯高于非CNSL患者和對照者，后兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示MMP-2可能有助于診斷CNSL[20]。原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤和非中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤細(xì)胞分泌型磷酸化糖蛋白1（secreted phosphorylated glycoprotein-1，SPP-1）存在差異表達(dá)[21]，急性B淋巴（母）細(xì)胞白血?。˙-acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者復(fù)發(fā)時腦脊液細(xì)胞中SPP-1蛋白表達(dá)水平比初診時顯著升高[22]，提示腦脊液SPP-1或許可以作為預(yù)測CNSL的潛在靶標(biāo)。

腦脊液中VEGF與受體結(jié)合，可促進(jìn)血管生成、增加血管通透性、破壞血腦屏障，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移。與非CNSL患者相比，伴CNSL的ALL患者腦脊液中VEGF水平明顯升高[23]。與血清樣本相比，腦脊液樣本中的細(xì)胞因子和趨化因子可更好地反映CNSL的狀態(tài)[10]。ROBERTS等[24]發(fā)現(xiàn)，趨化因子配體-2（chemokine ligand-2 ，CCL2）具有破壞血腦屏障的作用，有利于白血病細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，無論是腦脊液中，還是外周血中，CNSL患者的CCL2均高于非CNSL患者和對照者。CCL2增加與腫瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是CNSL的發(fā)生機(jī)制之一[25]。ALL患者腦脊液中的可溶性白細(xì)胞介素-2受體（soluble interleukin-2 receptor，sIL2-R）水平對白血病細(xì)胞的識別能力優(yōu)于腦脊液白細(xì)胞計數(shù)，腦脊液sIL2-R臨界值為10 U/mL時，診斷敏感性為89.5%，特異性為89.6%，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的客觀指標(biāo)。腦脊液sIL2-R水平或可作為診斷CNSL新的輔助指標(biāo)[26]。

總體而言，關(guān)于以上單一蛋白類標(biāo)志物對CNSL的診斷和預(yù)測作用，無論是特異性，還是敏感性，目前國內(nèi)外的相關(guān)研究仍缺乏實質(zhì)性的進(jìn)展，它們在臨床實踐中的價值仍不清楚，尚需要大樣本數(shù)據(jù)對相關(guān)指標(biāo)單用或聯(lián)用的診斷效能進(jìn)行更多的臨床評價。

4 腦脊液核酸檢測

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者FLT3通常高表達(dá)，可能與存在FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)基因（internal tandem duplication of the FLT3，F(xiàn)LT3-ITD）、FLT3/D835Mt突變或者混合譜系白血病串聯(lián)重復(fù)基因（tandem duplication of the mixed lineage leukemia gene，MLL-TD）相關(guān)，ALL患者也存在不同程度的FLT3表達(dá)[27-28]。OZEKI等[27]發(fā)現(xiàn)，CNSL患者腦脊液FLT3 mRNA陽性率及表達(dá)水平顯著高于完全緩解組和對照組非腫瘤患者，非CNSL患者腦脊液中FLT3基因表達(dá)多為陰性。腦脊液FLT3陽性組單個核細(xì)胞數(shù)高于陰性組，LDH水平也更高，提示腦脊液FLT3表達(dá)與CNSL發(fā)生密切相關(guān)[28]。腦脊液WT1 mRNA水平與CNSL以及血液學(xué)復(fù)發(fā)也有很強(qiáng)的相關(guān)性[29]。盡管不能覆蓋所有CNSL患者，但腦脊液中FLT3和WT1表達(dá)水平的改變或可作為CNSL更敏感的早期診斷和療效判斷指標(biāo)。同時采用MFC和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測疾病特異性的免疫球蛋白重連基因IGHR重排和/或T細(xì)胞受體基因TCR重排評估ALL患兒腦脊液白血病浸潤情況，并與傳統(tǒng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PCR檢測基因重排診斷CNSL的陽性率可達(dá)60%，MFC檢測的陽性率為46.6% ，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的陽性率僅為22.2%，MFC和PCR診斷效能是細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的2～3倍，提示腦脊液疾病特異性基因重排核酸檢測可作為ALL患者早期中樞浸潤敏感的診斷方法。然而，基因重排檢測需要設(shè)計個性化疾病特異性的PCR引物，耗時且檢測成本高，也需要足夠量的腦脊液和白血病細(xì)胞，技術(shù)要求高，而且較容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因而臨床易見MFC陽性但PCR不能檢出的情況，需要綜合判斷[30-31]，因此該技術(shù)臨床應(yīng)用尚不廣泛。

游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）是存在于血液、尿液、腦脊液等體液中的細(xì)胞外DNA。正常情況下，腦脊液cfDNA水平較低，中樞浸潤白血病/淋巴瘤患者腦脊液中可檢出腫瘤特異性的DNA——循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及其相關(guān)突變，輔助CNSL的診斷，可以彌補(bǔ)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查和MFC免疫分型的不足。約85%的初發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）患者攜帶MYD88（L265P）突變。數(shù)字PCR檢測腦脊液細(xì)胞DNA或cfDNA MYD88（L265P）突變診斷CNSL有極高的特異性[32]。有研究對中樞淋巴瘤組織靶向下一代測序（next generation sequencing，NGS），對獲得的突變位點，在外周血和腦脊液中采用數(shù)字PCR進(jìn)行個體化突變位點檢測，發(fā)現(xiàn)腦脊液cfDNA檢出率及突變頻率比血漿更高，且腦脊液檢測cfDNA與MFC免疫分型結(jié)果吻合度好[33]。對腦脊液行全外顯子測序，進(jìn)一步證實了腦脊液ctDNA診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤的高特異性，在系統(tǒng)性非中樞淋巴瘤患者腦脊液中均未檢測到ctDNA，且CNSL患者治療后，腦脊液MFC檢測陰性的患者，部分仍可檢出ctDNA[34]。

因此，基于普通PCR對腦脊液浸潤細(xì)胞DNA和/或RNA，以及cfDNA中腫瘤特異性突變位點進(jìn)行數(shù)字PCR或NGS檢測，可能是敏感性更高的原發(fā)或繼發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤檢測方法。

5 組學(xué)檢測

ROY等[35]采用基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）的方法，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)B細(xì)胞淋巴瘤與其他良性疾病患者的腦脊液中差異定量和鑒定了500種蛋白質(zhì)，將兩者進(jìn)行了有效區(qū)分。GUO等[36]使用LC-MS/MS對比ALL患兒和對照者的腦脊液，鑒定出51種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)并不是隨機(jī)的，相互之間有復(fù)雜的互動網(wǎng)絡(luò)，其中多種蛋白質(zhì)都與癌癥有關(guān)，提示白血病細(xì)胞相關(guān)蛋白可以出現(xiàn)在腦脊液中。MO等[37]采用LCMS/MS對6例ALL伴CNSL患兒治療前后的腦脊液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并繪制了CNSL患兒腦脊液的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜，量化了化療前后發(fā)生變化的蛋白質(zhì)，證實這些蛋白質(zhì)可作為ALL疾病進(jìn)展標(biāo)志物以及CNSL新的治療靶點。然而，上述研究[35-37]樣本量均較小，觀察周期相對較短，需要擴(kuò)大樣本量，并延長觀察時間，進(jìn)一步驗證這些改變的蛋白質(zhì)在CNSL診斷中的作用。

代謝組學(xué)主要通過色譜、質(zhì)譜與核磁共振技術(shù)，以及幾種技術(shù)的聯(lián)合使用，定性或定量分析內(nèi)源性小分子代謝物，繼而快速、系統(tǒng)、全面地檢測各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞生理或病理性代謝物變化，為疾病的早期診斷與預(yù)后監(jiān)測提供強(qiáng)有力的支持。目前，對血液病患者腦脊液代謝組學(xué)的研究較少。對腦原發(fā)或繼發(fā)中樞淋巴瘤、肺癌腦轉(zhuǎn)移或未轉(zhuǎn)移患者的腦脊液進(jìn)行代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，腦實體瘤患者與非腦實體瘤患者腦脊液在多種氨基酸和嘌呤代謝通路上存在顯著差異[38]。腦原發(fā)中樞淋巴瘤和肺癌腦轉(zhuǎn)移均存在植物鞘氨醇和L-谷氨酰胺水平的上調(diào)。植物鞘氨醇水平升高可能反映了相對較高的腫瘤細(xì)胞增殖速率和脂質(zhì)膜增加重塑；L-谷氨酰胺增高可能與腦腫瘤快速增長所需的高能耗相關(guān)[39]。與腦原發(fā)中樞淋巴瘤患者相比，繼發(fā)中樞淋巴瘤患者腦脊液中5-氨基咪唑上調(diào)，但肌醇磷酸、高半胱氨酸和戊基蛋氨酸下調(diào)，可以反映出2種疾病之間固有的病理生理差異，或可用于2種疾病的鑒別診斷[40]。有研究發(fā)現(xiàn)，采用8個代謝產(chǎn)物的組合，可以鑒別診斷肺癌腦轉(zhuǎn)移與非腦轉(zhuǎn)移，曲線下面積為0.91；6個代謝物鑒別診斷繼發(fā)中樞淋巴瘤與腦轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.87；提示代謝組學(xué)可區(qū)分不同腦腫瘤患者腦脊液的代謝物差異，初步顯示出其診斷不同類型腦腫瘤的巨大潛力[40]。本課題組正在進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，腦脊液代謝組學(xué)檢測可以有效輔助區(qū)分ALL患者中樞浸潤情況，且其確診CNSL的時間可能更短（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），提示采用腦脊液代謝組學(xué)進(jìn)行CNSL的診斷和鑒別診斷，具有明確的臨床可操作性和實際的臨床價值，值得進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行臨床研究和推廣應(yīng)用。對相關(guān)特異性代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步回溯分析，有助于從代謝角度理解腫瘤中樞浸潤可能的新機(jī)制。

6 總結(jié)

血液系統(tǒng)惡性腫瘤中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累患者臨床預(yù)后較差。腦脊液腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)篩查和MFC檢測是目前診斷CNSL的主要方法，但其敏感性、特異性尚不能滿足臨床需求。蛋白標(biāo)志物、核酸分析，各種組學(xué)評估臨床研究的開展有望在腦脊液樣本中發(fā)現(xiàn)新的CNSL標(biāo)志物，并可能更早提示CNSL的發(fā)生，但仍然需要更多的臨床研究數(shù)據(jù)支持。未來研究不僅要著眼于發(fā)現(xiàn)新的和更敏感、更特異的腦脊液分析方法和新的標(biāo)志物，還要通過多中心的大樣本臨床試驗來驗證已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物、代謝物的臨床實用性。