劉億婕

福建省食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院（福州 350000）

三文魚（Salmon），是鮭科魚類或鮭鱒魚類的商品名稱[1]，屬冷水性溯河產(chǎn)卵洄游魚類[2]。其鱗小刺少，肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，同時(shí)營養(yǎng)價(jià)值豐富[3-4]，因此深受人們的喜愛。隨著人們對(duì)三文魚消費(fèi)需求的增長，國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)都在不斷擴(kuò)大三文魚的養(yǎng)殖規(guī)模。在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；耐瑫r(shí)，寄生蟲病也隨之出現(xiàn)[5]。魚虱病是海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖鮭鱒魚類常見的寄生蟲性疾病[6-7]，也是困擾養(yǎng)殖者的一大難題。魚虱大量寄生在魚體，引起魚體糜爛、損傷、出血，甚至死亡，嚴(yán)重危害著養(yǎng)殖業(yè)。目前對(duì)于魚虱病的治療主要有藥浴治療及飼料中預(yù)混殺蟲藥物[8]。除蟲脲是一種能抑制靶標(biāo)害蟲的幾丁質(zhì)合成而導(dǎo)致其死亡或不育的殺蟲劑，常用于鮭鱒魚類魚虱病的治療[9]。然而除蟲脲的過渡或不合理使用會(huì)導(dǎo)致藥物在魚體內(nèi)的殘留，進(jìn)而危害人的身體健康。歐盟、挪威、智利和日本都制定了除蟲脲在鮭科魚肉中的最大殘留限量（MRL），而中國尚未制定此限量。

除蟲脲的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[10-11]、液相色譜-質(zhì)譜法[12-13]。前處理中常用的凈化方式主要有固相萃取柱凈化法[14]和QuEChERS凈化法[15]。在目前報(bào)道的文獻(xiàn)及現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)除蟲脲殘留的檢測(cè)主要集中在蔬菜、水果等植物性食品中。劉錦霞等[16]建立了豬肉中苯甲酰脲類的檢測(cè)方法。GB 23200.45—2016[12]可適用于雞肉、牛肉、豬肉、豬肝等基質(zhì)，但是三文魚等鮭鱒魚類水產(chǎn)品中除蟲脲殘留的檢測(cè)未見報(bào)道。試驗(yàn)采用QuEChERS法進(jìn)行前處理，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定三文魚中除蟲脲的殘留。該方法簡單、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于三文魚中除蟲脲的快速檢測(cè)，填補(bǔ)了三文魚等鮭鱒魚類中除蟲脲殘留檢測(cè)的空白，同時(shí)為國內(nèi)及進(jìn)口三文魚中除蟲脲殘留的監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API QTrap5500 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（美國AB公司）；ExionLC AD高效液相色譜儀（美國AB公司）；XPE206DR分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Vortex 4渦旋混合器（德國IKA公司）；CR21N型落地式高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司）。

除蟲脲對(duì)照品（A Chem Tek公司）；乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷（色譜純，德國Merck公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁公司）；氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、硅膠鍵合十八烷基（C18）、石墨化碳黑（GCB），納譜分析技術(shù)有限公司；超純水由Milli Q系統(tǒng)制得（美國Milipore公司）；三文魚（市售）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋配成1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱保存。試驗(yàn)時(shí)用空白基質(zhì)溶液稀釋成含除蟲脲質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，8.0和10.0 μg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

取約100 g代表性樣品，用絞肉機(jī)絞碎混勻，裝入干凈的自封袋內(nèi)，密封并標(biāo)明編號(hào)，于-20 ℃冷凍保存。

準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.01 g）試樣，置于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水和2 g NaCl渦旋混勻，樣品充分分散后，加入10 mL 1%甲酸-乙腈，渦旋1 min，超聲提取10 min，以9 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液加入到裝有50 mg PSA的離心管中，渦旋1 min，以9 000 r/min離心5 min，過0.22 μm的濾膜后，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1 液相色譜條件

Eclipse Plus-C18RRHD色譜柱（2.1 nm×50 nm，1.8 μm）；流動(dòng)相：純水（A相）、乙腈（B相）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：40 ℃。液相色譜梯度洗脫程序：0～1 min，90% A；1～2 min，90%～5% A；2～3 min，5% A；3～4 min，5%～90% A；4～5 min，90% A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI源），負(fù)離子模式（ESI-）檢測(cè)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子源溫度：450 ℃；電噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣壓力：35 Psi；霧化氣壓力：55.0 Psi；輔助氣壓力：55.0 Psi；碰撞室入口電壓：-10 V；碰撞室出口電壓：-15 V。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)

水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，含有較高的蛋白質(zhì)和脂肪等雜質(zhì)，易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。因此，試驗(yàn)考察了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物的影響。采用提取后加入法[17]，用純?nèi)軇┡c空白基質(zhì)提取液分別配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定，根據(jù)公式ME=Am/As對(duì)基質(zhì)效應(yīng)（ME）進(jìn)行評(píng)價(jià)。式中Am為魚肉空白基質(zhì)中除蟲脲的吸光度，As為溶劑中除蟲脲的吸光度。當(dāng)ME=1時(shí)，表示無基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＞1時(shí)，表示基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME＜1時(shí)，表示基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)產(chǎn)生減弱效應(yīng)。當(dāng)0.8＜ME＜1.2時(shí)，表示為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)0.5＜ME＜0.8或1.2＜ME＜1.5時(shí)，表示為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＜0.5或ME＞1.5時(shí)，表示為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

配制50 ng/mL的除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵進(jìn)樣方式將其注入離子源，離子源選擇負(fù)離子模式。先找到準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-（母離子），再對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子信息。選擇豐度較大、丟失合理的子離子分別作為定量離子和定性離子，并對(duì)去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使各離子碎片響應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

表1 除蟲脲質(zhì)譜檢測(cè)條件參數(shù)

在色譜條件方面，主要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)比較了乙腈-5 mmoL/L乙酸銨、乙腈-水、甲醇-水分別作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)各物質(zhì)的峰型及響應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)，響應(yīng)更好，峰型也不會(huì)拖尾。所以最終流動(dòng)相水（A相）和乙腈（B相）進(jìn)行梯度洗脫。流速為0.3 mL/min，最終組分在5 min內(nèi)出峰。色譜圖見圖1。

圖1 除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖（A）和定量、定性離子流圖（B和C）

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇

樣品在提取之前先加少量的水，使之分散均勻，便于目標(biāo)化合物的提取。由于用甲醇提取不利于后續(xù)提取液與水相的分層，因此試驗(yàn)將加標(biāo)量為10 μg/kg的空白魚肉樣品分別用乙腈、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷提取，考察各提取溶劑對(duì)回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。用正己烷提取時(shí)回收率不到10%，不能把除蟲脲提取出來，而用乙腈提取的回收率高于乙酸乙酯、二氯甲烷，且乙腈可沉淀蛋白，同時(shí)可減少脂類等弱極性組分的提取，所以初步選擇乙腈作為提取溶劑。由于除蟲脲在酸性條件下比較穩(wěn)定，因此選擇不同酸度條件下的乙腈提取。比較了0.1%甲酸-乙腈、0.5%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈和5%甲酸-乙腈分別作為提取劑的提取效果，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，加入甲酸提取比單獨(dú)用乙腈提取回收率更高，且隨著甲酸添加量的增加，回收率也呈增高的趨勢(shì)，當(dāng)甲酸為1%時(shí)回收率最高，5%時(shí)有所下降，最終提取溶劑選擇1%甲酸-乙腈。

圖2 不同提取溶劑對(duì)除蟲脲提取效率的影響

圖3 不同酸度的乙腈溶液對(duì)除蟲脲提取效率的影響

2.2.2 凈化劑的選擇

QuEChERS方法中常用的凈化劑有PSA、C18、GCB等。PSA主要用于除去樣品中的脂肪酸、酚類碳水化合物等[19-20]，C18具有良好的除脂能力[21]，而GCB通常用來除去樣品中的色素，同時(shí)GCB會(huì)吸附一些具有平面及對(duì)稱結(jié)構(gòu)的化合物[22]。為考察不同凈化劑的凈化效果，試驗(yàn)將加標(biāo)量為10 μg/kg的空白魚肉樣品進(jìn)行前處理，考察了PSA、C18、GCB及其兩兩組合（保持凈化劑的總量不變）作為凈化劑的凈化效果及對(duì)回收率的影響。圖4顯示：當(dāng)添加GCB時(shí)，回收率均很低，說明GCB對(duì)目標(biāo)物有較強(qiáng)的吸附。PSA、C18及其兩者的組合均有較好的凈化效果，但PSA單獨(dú)作為凈化劑時(shí)回收率略高于C18及兩者的組合，因此選取PSA作為凈化劑。進(jìn)一步考察凈化劑的用量對(duì)回收率的影響。將加標(biāo)量為10 μg/kg的空白魚肉樣品提取后，考察了25，50，75，100和150 mg PSA分別作為凈化劑對(duì)回收率的影響。結(jié)果（圖5）表明：50 mg PSA在達(dá)到較好的凈化效果的同時(shí)也可以滿足較好的回收率，再增加PSA的用量回收率呈下降趨勢(shì)，最終選擇50 mg PSA作為凈化劑。

圖4 不同凈化劑對(duì)除蟲脲的凈化效果

圖5 不同質(zhì)量的PSA對(duì)除蟲脲的凈化效果

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

分別用溶劑（10%乙腈水溶液）和空白魚肉基質(zhì)提取液配制成含除蟲脲質(zhì)量濃度為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣3次，以空白基質(zhì)中除蟲脲峰面積與溶劑中除蟲脲峰面積之比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果（表3）顯示：除蟲脲在魚肉基質(zhì)中表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果帶來的誤差，在實(shí)際樣品的檢測(cè)中采用基質(zhì)配標(biāo)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

稱取6份陰性魚肉樣品，按前處理方法處理得到空白基質(zhì)，以空白基質(zhì)為稀釋劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以被測(cè)物峰面積為縱坐標(biāo)，以被測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：除蟲脲在0.5～10 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

同時(shí)進(jìn)行檢出限、定量限測(cè)定試驗(yàn)，陰性樣品加標(biāo)后，按1.3小節(jié)的方法處理后上機(jī)測(cè)定，以信噪比（S/N）3和10分別確定方法的檢出限（SLOD）和定量限（SLOQ），結(jié)果見表2。方法檢出限為0.15 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，定量限低于GB 23200.45—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中除蟲脲殘留量的測(cè)定》的規(guī)定（定量限為10 μg/kg）。

表2 除蟲脲的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 方法回收率和精密度

在魚肉陰性樣品中添加低（5 μg/kg）、中（10 μg/kg）、高（20 μg/kg）3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3小節(jié)的樣品前處理方法進(jìn)行處理，每個(gè)水平的加標(biāo)試驗(yàn)做6個(gè)平行樣，各水平的加標(biāo)量和結(jié)果見表3。除蟲脲的回收率在87.3%～96.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～2.2%之間，回收率及精密度良好，符合檢測(cè)要求。

表3 除蟲脲平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）及基質(zhì)效應(yīng)（n=3）

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從超市購買5份三文魚樣品，按試驗(yàn)方法檢測(cè)，均未檢出除蟲脲殘留。將5份樣品都稱2個(gè)平行樣，并按10 μg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行加標(biāo)，前處理后上機(jī)得到平均回收率，結(jié)果分別為95.4%，92.3%，95.0%，94.3%和93.6%，再次證明該方法的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了三文魚中除蟲脲殘留的QuEChERS/LC-MS/MS分析方法。該方法前處理簡單，檢測(cè)周期短，基質(zhì)干擾少，在3個(gè)添加水平（n=6）下的回收率為87.3%～96.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～2.2%，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，方法檢出限為0.15 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，低于GB 23200.45—2016中定量限，也低于歐盟、挪威制定的最大殘留限量。該方法準(zhǔn)確、可靠，為三文魚中除蟲脲殘留監(jiān)測(cè)提供了有力的技術(shù)手段。