黃世炎，張藝琴，楊 壹，蒙運(yùn)鐸，廖澤函，黃桂香

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，南寧 530005）

‘沃柑’原產(chǎn)于以色列，2004 年由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所從韓國(guó)引進(jìn)，該品種具有樹(shù)勢(shì)強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)、晚熟、早實(shí)豐產(chǎn)等特性[1]。在廣西、云南等地區(qū)有大面積種植，其中廣西種植面積已超過(guò)10萬(wàn)hm2[2-3]。黃龍病是‘沃柑’等柑橘類的毀滅性病害，病原菌為專性寄生韌皮部的革蘭氏陰性細(xì)菌，分為3 個(gè)亞種，即亞洲種（CandidatusLiberibacter asiaticu ）、美洲種（CandidatusLiberibacter americanus）和非洲種（CandidatusLiberibacter africanus）[4-5]。全球大多數(shù)柑橘產(chǎn)區(qū)危害嚴(yán)重，華南地區(qū)為黃龍病發(fā)生流行區(qū)，目前仍無(wú)有效的防治方法，生產(chǎn)上主要采用“種植無(wú)病毒苗木、防控木虱和清除病樹(shù)”的“三板斧”法，樹(shù)體管理、田間診斷等對(duì)防控黃龍病流行有重要意義。本研究對(duì)健康和感染黃龍病的‘沃柑’秋梢葉片的形態(tài)、生理生化指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)元素和果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)并比較分析，以期為柑橘黃龍病的綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020 年9—12 月在廣西壯族自治區(qū)南寧市廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院標(biāo)本園進(jìn)行，供試品種為‘沃柑’，試驗(yàn)期間除加強(qiáng)木虱防控外，其他均為常規(guī)田間管理。通過(guò)黃龍病菌定量檢測(cè)，檢測(cè)出黃龍病陽(yáng)性株（感病株）和陰性株（健康株），并從感病株和健康株中各選取5 株，分別采集感病株新葉、感病株成熟葉、健康株新葉、健康株成熟葉、感病株果實(shí)、健康株果實(shí)。新葉為秋梢已經(jīng)完全展開(kāi)的葉片，成熟葉為秋梢已經(jīng)老熟的葉片。采集的葉片為樹(shù)冠東、西、南、北、中5 個(gè)方位的秋梢上的第3～4 片葉。每株樹(shù)分別采集樹(shù)冠下層的果實(shí)10 個(gè)，中上層的果實(shí)20 個(gè)，共30 個(gè)果實(shí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃龍病檢測(cè)

使用混合葉樣，參考劉麗等[6]的方法提取DNA。再參考Bao 等[7]的方法對(duì)CLas 進(jìn)行qPCR 檢測(cè)，上游引物為HLBas（TCGAGCGTATGCAATACG），下游引物為 HLBr（GCGTTATCCCGTAGAAAAAGG TAG），探針為HLBp（FAM-AGACGGGTGAGTAA CGCG-BHQ）。使用儀器為qPCR 儀（LightCycler?96 lnstrument，美國(guó)）。以超純水為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)室保存的黃龍病菌樣品為陽(yáng)性對(duì)照，健康‘沃柑’葉片為陰性對(duì)照。

1.2.2 葉片長(zhǎng)度和寬度的測(cè)定

采樣后，使用國(guó)產(chǎn)電子數(shù)顯卡尺（桂林量具刃具有限責(zé)任公司）測(cè)量葉片長(zhǎng)度和寬度。

1.2.3 葉片葉綠素相對(duì)含量的測(cè)定

葉片葉綠素相對(duì)含量（SPAD 值）用MultiSpeQ多功能植物測(cè)量?jī)x（PhotosynQ，美國(guó)）在田間實(shí)地測(cè)量，每株樹(shù)選取東、西、南、北、中5 個(gè)方位，測(cè)量秋梢新葉片和成熟葉片的葉綠素相對(duì)含量。

1.2.4 葉片生理指標(biāo)的測(cè)定

葉片生理指標(biāo)過(guò)氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量使用酶活性檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進(jìn)行測(cè)定，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，利用UV-8000 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）測(cè)定OD 值，最后計(jì)算酶活性。

1.2.5 葉片礦質(zhì)元素含量的測(cè)定

葉片N 含量使用H2SO4-H2O2消煮法-FIA 法[8]進(jìn)行測(cè)定；P、K 含量使用H2SO4-H2O2消煮法-ICP法[9-10]測(cè)定；Ca、Mg、Cu 和Zn 含量采用鹽酸浸提-ICP 法進(jìn)行測(cè)定[11]。測(cè)定儀器為BDFIA-9000（北京寶德儀器有限公司）、ICP-5000（北京吉天儀器有限公司）。

1.2.6 果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

人工統(tǒng)計(jì)每株柑橘樹(shù)的果實(shí)總數(shù)，并隨機(jī)采集果實(shí)，用于測(cè)定果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)。使用SQP 電子天平（Sartorius，北京）稱量單果重；使用電子天平稱量經(jīng)手動(dòng)榨汁機(jī)處理后的果汁重量，計(jì)算出汁率；使用電子數(shù)顯卡尺測(cè)量果皮厚度；使用PAL-BX/ACID1 柑橘糖酸度計(jì)（ATAGO，日本）測(cè)定糖酸比；采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]測(cè)定果實(shí)維生素C 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 18.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，利用Excel 2019 軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’葉片大小的影響

如圖1 所示，感病株成熟葉片的平均長(zhǎng)度顯著小于健康株成熟葉片，分別為74.51 mm 和81.11 mm；而感病株和健康株的新葉平均長(zhǎng)度分別為68.36 mm 和72.50 mm，且二者間無(wú)顯著差異。感病株成熟葉的平均寬度也顯著小于健康株成熟葉，分別為34.09 mm 和38.05 mm；感病株和健康株的新葉平均寬度分別為30.09 mm 和31.68 mm，二者之間也無(wú)顯著差異。可見(jiàn)，與‘沃柑’健康株相比，感染黃龍病會(huì)影響‘沃柑’葉片的生長(zhǎng)發(fā)育，使成熟葉片的長(zhǎng)度和寬度顯著小于健康株，但對(duì)新葉的長(zhǎng)度和寬度均無(wú)顯著影響。

圖1 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的葉片長(zhǎng)度和寬度

2.2 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’葉片葉綠素相對(duì)含量的影響

如圖2 所示，感病株成熟葉片的葉綠素相對(duì)含量（SPAD 值）為53.65，顯著低于健康株成熟葉片（63.17）；感病株和健康株新葉中的葉綠素相對(duì)含量分別為31.10 和34.77，二者之間無(wú)顯著差異。這一結(jié)果說(shuō)明感染黃龍病會(huì)顯著影響‘沃柑’葉片的光合作用。

圖2 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的葉綠素相對(duì)含量

2.3 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’葉片生理指標(biāo)的影響

由表1 可以看出，與‘沃柑’健康株相比，感病株新葉和成熟葉片的CAT 活性均顯著降低，分別降低了558.76、659.74 U/g；PAL 活性均顯著增加，分別增加了35.39、83.04 U/g。但新葉和成熟葉片的SOD、POD 活性和MDA 含量在黃龍病株與健康株之間均未表現(xiàn)出顯著性差異。

表1 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的葉片酶活性

2.4 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’葉片營(yíng)養(yǎng)元素的影響

由表2 可知，與‘沃柑’健康株新葉相比，感病株新葉的N、P、K 含量均顯著降低，分別降低了17.42%、22.73%、28.75%；Ca、Cu、Mg、Zn 含量均無(wú)顯著差異。與‘沃柑’健康株成熟葉片相比，感病株成熟葉片的P、K 含量均顯著降低，分別降低了36.36%、22.96%；Ca、Cu 含量均顯著增加，分別增加了61.72%、30.36%；N、Mg、Zn 含量均無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，感染黃龍病對(duì)‘沃柑’葉片礦質(zhì)元素含量有一定的影響。

表2 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的葉片礦質(zhì)元素含量

2.5 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’果實(shí)品質(zhì)的影響

2.5.1 結(jié)果數(shù)量和果實(shí)品質(zhì)

從表3 可以看出，與‘沃柑’健康株相比，感病株的單果重、出汁率和糖酸比均顯著降低，分別降低了33.22%、5.33%和14.31%；果實(shí)維生素C 含量卻顯著增加，增加了850.8 mg/kg。此外，感病株的單株結(jié)果數(shù)和果皮厚度和健康株相比均無(wú)顯著差異。

表3 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的果實(shí)品質(zhì)

2.5.2 種子敗育情況

由表4 可知，感病株和健康株果實(shí)種子總數(shù)無(wú)顯著差異，但感病株果實(shí)的敗育種子數(shù)和敗育比均顯著增加。

表4 ‘沃柑’黃龍病株與健康株敗育種子情況

3 結(jié)論與討論

3.1 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’葉片大小的影響

眾多研究均表明，黃龍病菌的侵染通過(guò)影響柑橘植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收、光合作用以及其他新陳代謝，從而影響感病后新生葉片的發(fā)育，導(dǎo)致成熟后葉片變小。Bové[4]在其對(duì)黃龍病的研究中也指出，柑橘植株感染黃龍病后葉片會(huì)出現(xiàn)黃化、變小等癥狀，該結(jié)論與本文感染黃龍病‘沃柑’葉片大小變化相一致。

3.2 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’葉片生理指標(biāo)的影響

植物抗性與其形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及自身的MDA、PAL 等生理生化物質(zhì)相關(guān)，當(dāng)植物體受到病原菌侵染時(shí)會(huì)引起相應(yīng)的變化，如葉片細(xì)胞膜透性增加、葉綠素含量下降、MDA 含量提高等[13-15]。逆境會(huì)刺激CAT 活性升高，同時(shí)又會(huì)使植物組織受到損害而后使CAT 活性降低[16]。易龍等[17]在柑橘黃龍病菌侵染對(duì)‘紐荷爾’臍橙組織的研究中發(fā)現(xiàn)，黃龍病菌侵染會(huì)使葉片葉綠素含量降低，使POD、CAT、SOD活性和MDA 含量顯著升高。本研究亦發(fā)現(xiàn)感病株成熟葉片的葉綠素相對(duì)含量顯著下降，PAL 活性顯著升高，與上述研究結(jié)果一致；CAT 活性顯著降低，說(shuō)明感染黃龍病對(duì)其部分組織已造成損傷。

3.3 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’葉片礦質(zhì)元素的影響

感染黃龍病會(huì)影響葉片礦質(zhì)元素的含量，其原因與黃龍病感染使柑橘根系受損、韌皮部阻塞，進(jìn)而影響根系對(duì)礦質(zhì)元素的吸收有關(guān)。Razi 等[18]在其柑橘植物營(yíng)養(yǎng)概況與黃龍病的研究中發(fā)現(xiàn)，感染黃龍病會(huì)使葉片N、Ca、Mg、Zn 含量降低。管冠等[19]在黃龍病對(duì)‘紐荷爾’葉片營(yíng)養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，Ca含量在黃龍病株中顯著增加。同時(shí)，曹繼容[20]研究發(fā)現(xiàn)，不同柑橘品種和不同季節(jié)的葉片N、P 含量的變化會(huì)有所差異。本研究中，與健康株相比，感病株新葉的N、P、K 含量均顯著降低；成熟葉片的Ca、Cu 含量顯著增加，K、P 含量顯著降低，而Mg和Zn 含量均無(wú)顯著變化。

3.4 感染黃龍病對(duì)‘沃柑’果實(shí)品質(zhì)的影響

黃龍病病原菌侵染后，柑橘韌皮部受阻，阻礙了光合產(chǎn)物的運(yùn)輸，同時(shí)感染黃龍病后葉片光合作用下降，使光合產(chǎn)物的積累減少，因此導(dǎo)致黃龍病株單果重、糖酸比、出汁率均顯著下降[21-23]。本研究通過(guò)對(duì)單果重、出汁率、糖酸比等指標(biāo)的測(cè)定，亦得出相同結(jié)論。

相關(guān)研究表明，果實(shí)中維生素C 含量與礦質(zhì)元素Ca、Zn 的含量呈正相關(guān)[24]。王飛燕等[25]以‘沙田柚’為試材的研究表明果實(shí)維生素C 顯著升高，而劉家容等[26]以‘春甜橙’為試材的研究結(jié)果相反。王圣通[27]在黃龍病對(duì)柑橘果實(shí)品質(zhì)的影響中亦指出不同試驗(yàn)材料品種會(huì)有不同的結(jié)論。推測(cè)研究結(jié)果不一致的原因可能是由于試驗(yàn)材料品種不同所導(dǎo)致。在本研究中，與‘沃柑’健康株相比，感病株果實(shí)維生素C 含量顯著增加，這可能與感病株葉片Ca 含量升高有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，感病株與健康株的種子總數(shù)無(wú)顯著性差異，但敗育種子數(shù)卻顯著增多，說(shuō)明感染黃龍病會(huì)導(dǎo)致‘沃柑’果實(shí)種子敗育。王飛燕等[25]以‘沙田柚’的試驗(yàn)材料亦發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果。

綜上，感染黃龍病對(duì)‘沃柑’秋梢葉片大小及其相關(guān)理化指標(biāo)有一定影響，同時(shí)也對(duì)果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生影響。因研究時(shí)間有限，本文未包括不同季節(jié)葉樣比較和年度間重復(fù)比對(duì)，有待進(jìn)一步研究完善。