王澄瑤 李旭 盧曉云?

1) (西安交通大學(xué)，瞬態(tài)電磁環(huán)境與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合研究中心 西安 710049)

2) (西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，線粒體生物醫(yī)學(xué)研究所，生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710049)

用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)皿無(wú)法直接用于激光共聚焦顯微鏡的觀察，在很大程度上限制了細(xì)胞水平上的太赫茲生物效應(yīng)研究的開(kāi)展.本文采用了對(duì)太赫茲吸收率低的材料—環(huán)烯烴聚合物(COP)，與聚二甲基硅氧烷(PDMS)進(jìn)行共鍵合，借用軟蝕刻、光刻、等離子清洗和高溫高壓孵育技術(shù)將兩種材料整合成新型微流控芯片，并利用該微流控芯片探索太赫茲對(duì)腸道細(xì)胞的生物效應(yīng).該微流控芯片可實(shí)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞Caco-2的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，原位免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡的直接觀察，為太赫茲細(xì)胞水平的生物效應(yīng)研究提供了高效便捷的實(shí)驗(yàn)環(huán)境.研究中將微流控芯片中培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞Caco-2 經(jīng)15 mW/cm2 的0.1 THz 波輻照10 min，免疫熒光染色結(jié)果顯示細(xì)胞貼附生長(zhǎng)的形態(tài)改變，胞間緊密連接蛋白ZO-1 及樁蛋白Paxillin 的水平及分布發(fā)生變化，提示太赫茲對(duì)細(xì)胞的胞外連接及胞間連接均可產(chǎn)生影響，可減弱細(xì)胞與培養(yǎng)界面的黏附.本研究設(shè)計(jì)制備的COP-PDMS 共鍵合微流控芯片為探索太赫茲對(duì)細(xì)胞的生物效應(yīng)提供了便捷有效的平臺(tái)，有望在未來(lái)進(jìn)一步用于太赫茲對(duì)細(xì)胞分子效應(yīng)的實(shí)時(shí)研究.

1 引言

太赫茲(terahertz，THz)是介于電子學(xué)和光子學(xué)之間的一個(gè)特殊波段，其波段的頻率范圍與生物分子骨架的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)頻率相當(dāng)[1]，輻射能級(jí)與生物分子間的弱相互作用的能級(jí)較為一致[2].因此，目前認(rèn)為太赫茲波在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具備一些其他頻段電磁波所不可替代的優(yōu)勢(shì).除了目前已大量開(kāi)展的太赫茲時(shí)域光譜對(duì)生物分子特征指紋的鑒定及生物組織成像之外[3]，太赫茲的生物效應(yīng)研究也成為太赫茲技術(shù)應(yīng)用研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域.研究發(fā)現(xiàn)，太赫茲對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)、細(xì)胞膜功能、生物分子互作均產(chǎn)生一定程度的作用，提示了太赫茲可在分子細(xì)胞水平上對(duì)生命活動(dòng)的多個(gè)方面產(chǎn)生影響[4]，如太赫茲輻射能夠促進(jìn)細(xì)胞微絲蛋白Actin 的聚合[5]，太赫茲破壞皮膚組織的同時(shí)增加了抑制腫瘤的蛋白質(zhì)[6]，以及太赫茲可造成神經(jīng)元膜屏障特性的可逆破壞，從而使得對(duì)化合物的通透性增加[7].

然而，目前研究太赫茲在細(xì)胞水平上的生物效應(yīng)研究的局限性在于難以進(jìn)行對(duì)細(xì)胞或分子樣品的實(shí)時(shí)同步觀察或檢測(cè).目前用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)皿的主要材料為聚苯乙烯(polystyrene，PS)，如需進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，則通常采用底部為石英材質(zhì)的培養(yǎng)皿或制備細(xì)胞爬片來(lái)進(jìn)行，這兩種材料特別是石英被報(bào)道在0.5—2.5 THz 波段下對(duì)太赫茲的吸收率較高[8-10]，難以將細(xì)胞直接培養(yǎng)進(jìn)行太赫茲輻照并實(shí)現(xiàn)激光共聚焦顯微鏡的觀察.一款新材料—環(huán)烯烴聚合物(cyclic olefin polymer，COP)的出現(xiàn)或可解決太赫茲在傳輸?shù)郊?xì)胞過(guò)程中被吸收的問(wèn)題，該材料對(duì)太赫茲的吸收低于其他常規(guī)用于細(xì)胞培養(yǎng)的材料[9，11，12].本文利用COP在0.5—2.5 THz 波段下對(duì)太赫茲吸收率低的特點(diǎn)，結(jié)合微流控技術(shù)的靈活性和可設(shè)計(jì)性，將COP 用于適合太赫茲細(xì)胞效應(yīng)研究的微流控芯片的制備中.而用于常規(guī)微流控芯片制作的聚甲基丙烯酸甲酯(poly(methylmethacrylate)，PMMA)、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)、聚碳酸酯 (polycarbonate，PC)，以及聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)等材料中，因PDMS 具有出色的可塑性，其在軟蝕刻和光刻中的多次復(fù)制溝道技術(shù)中應(yīng)用極廣.與PMMA，PET 和PC 相比，PDMS 具有較低的太赫茲的吸收率[8，11，13]，但其對(duì)太赫茲的吸收率在0.5 THz 波段下仍高于4.5 cm—1[8].本文將PDMS 和COP 結(jié)合起來(lái)，利用PDMS 在溝道復(fù)制中的優(yōu)勢(shì)以及COP 對(duì)太赫茲的低吸收率的特性，設(shè)計(jì)并制備了COP-PDMS 微流控芯片模型，并利用微流控芯片探索了太赫茲對(duì)腸道上皮細(xì)胞的生物效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了基于COP-PDMS 微流控芯片的細(xì)胞培養(yǎng)、太赫茲輻照干預(yù)和激光共聚焦檢測(cè)的一體化.

2 研究方法

2.1 太赫茲吸收率檢測(cè)

采用太赫茲三維層析成像系統(tǒng)(QT-TO1000)基于太赫茲時(shí)域光譜探測(cè)COP 和PDMS 樣片的透射信號(hào).通過(guò)調(diào)節(jié)該系統(tǒng)中器件的相對(duì)位置將光路調(diào)節(jié)至最佳狀態(tài)，將待測(cè)樣片放置于太赫茲光路聚焦光斑位置，掃描樣品置于聚焦光路中的太赫茲透射信號(hào)作為樣品測(cè)試信號(hào).參考信號(hào)為無(wú)樣片時(shí)的太赫茲透射信號(hào).其中，COP 和PDMS 樣片的厚度均為1.6 mm.

2.2 微流控芯片設(shè)計(jì)及制作

在前期微流控芯片設(shè)計(jì)工作的基礎(chǔ)上[14，15]，優(yōu)化本COP-PDMS 微流控芯片中單個(gè)芯片模塊的設(shè)計(jì)參數(shù)為:2.6 cm × 1.5 cm × 0.1 cm (長(zhǎng)×寬×高)(圖A1).模具制作和重復(fù)倒模過(guò)程如圖1 所示，具體步驟如下:設(shè)計(jì)的微流控溝道采用軟蝕刻技術(shù)通過(guò)光刻模式形成以SU-8 光刻膠和硅片為基底的圓形陣列式模具，采用含有機(jī)硅和固化劑的SYLGARD 184 硅膠套件 (Dow Chemical，USA)制備PDMS 器件.有機(jī)硅和固化劑按9∶1 的比例混合，倒入模具，將模具放置在真空脫氣室中 (Bel-Art Products，USA)過(guò)夜以清除混合后液體PDMS中的空氣，再放入80 ℃的烘箱中烘烤6 h 固化成型.PDMS 模塊固化后，用打孔器切割出0.75 mm的孔徑作為微流控通道的進(jìn)出口并連接連接管.微流控連接管的尺寸為內(nèi)徑0.25 mm，外徑0.75 mm.

圖1 COP-PDMS 共鍵合微流控芯片倒模制作圖例 (a) 通過(guò)光刻技術(shù)形成以SU-8 和硅片為基底的圓形微流控芯片陣列式模具;(b) 切割后的單個(gè)微流控芯片模塊;(c) PDMS 模塊與COP 板材通過(guò)等離子處理后鍵合;(d) 在形成的COP-PDMS 微流控溝道中進(jìn)行動(dòng)態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)的側(cè)面圖;(e) 含有細(xì)胞的微流控溝道的三維圖Fig.1.Schematic fabrication process of COP-PDMS co-bonded microfluidic device:(a) Using soft lithography technology to prepare the round microfluidic device array mold on the SU-8 and silicon wafer;(b) the single microfluidic device module;(c) the PDMS module and COP plate are fabricated by plasma treatment;(d) side view of cells dynamically cultured in the COP-PDMS microfluidic channel;(e) three-dimensional view of microfluidic channels containing cells.

2.3 COP-PDMS 鍵合

采用的COP 板材由COP 顆粒壓制而成，通過(guò)上述2.1 節(jié)中的方法在實(shí)驗(yàn)室加工PDMS，兩種材料的厚度均為1.6 mm.由于COP 和PDMS 材料表面的疏水性，兩種材料無(wú)法在表面未處理的情況下進(jìn)行鍵合，因此有必要對(duì)COP 和PDMS 表面進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)修飾.利用等離子體清洗機(jī)(PLUTO-T)處理引入極性基團(tuán)，COP 表面的化學(xué)鍵由疏水性(C—H 鍵)變?yōu)橛H水性(C—OH，C—NH，—COOH鍵);而PDMS 由重復(fù)的—O—Si(CH3)2—基團(tuán)組成，極性基團(tuán)，如硅醇基團(tuán)(Si—OH)，通過(guò)將PDMS塊暴露在空氣等離子體中引入.因此，當(dāng)含有這些極性基團(tuán)的COP 和PDMS 表面接觸時(shí)，兩種材料表面產(chǎn)生脫水反應(yīng)后形成化學(xué)鍵，可以被緊密黏合密封.根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的COP 以及PDMS 鍵合的條件[14-16]，本文中等離子處理?xiàng)l件為:真空度0.024 kPa，空氣流量參數(shù)為180 mL/min，發(fā)射功率150 W，時(shí)間60 s，COP 與PDMS 黏合后的烘烤溫度為80 ℃，烘烤時(shí)長(zhǎng)為 6 h.

2.4 鍵合強(qiáng)度測(cè)試

在采用已報(bào)道的鍵合條件進(jìn)行COP-PDMS鍵合后，由于其鍵合強(qiáng)度無(wú)法滿足本研究中所模擬不同器官內(nèi)流體剪切應(yīng)力所需的高灌注流量，因此，對(duì)COP-PDMS 的鍵合方式進(jìn)行進(jìn)一步改良，在高溫烘烤過(guò)程中通過(guò)添加重物給COP-PDMS表面以添加不同的壓強(qiáng)(0，125，250，750，1000，1250，2500，3750 和5000 Pa)，加壓的原因是為了應(yīng)對(duì)COP 板與PDMS 模塊的表面不平整而造成二者鍵合不牢固，由于PDMS 的硬度不高且具有彈性，加壓后可使得COP 與PDMS 的接觸面增大，從而抵消了板子不平整而產(chǎn)生的鍵合不牢固的問(wèn)題.在鍵合完成后通過(guò)推拉力計(jì)測(cè)試COP 和PDMS 的鍵合強(qiáng)度，即通過(guò)側(cè)面推拉的方式完全剝離兩種材料所需的剪切應(yīng)力

其中F是推拉力計(jì)的輸出數(shù)據(jù)，A為微流控芯片單個(gè)模塊的面積，推拉力計(jì)的輸出速度控制為0.2 mm/s.

2.5 生物流體剪切應(yīng)力對(duì)應(yīng)的微流控灌注流量計(jì)算

為計(jì)算在微流控芯片中模擬與生物體內(nèi)一樣水平的流體剪切應(yīng)力所需的灌注流量，假設(shè)在微流控溝道中的液體為牛頓液體，流動(dòng)方式為層流，重力影響忽略不計(jì)，流體剪切應(yīng)力計(jì)算方式如下:

其中τ1為生物各個(gè)組織器官中的流體剪切應(yīng)力;μ為牛頓液體動(dòng)態(tài)黏性系數(shù)，常溫下，水的動(dòng)態(tài)黏性系數(shù)為8.90 × 10—3dyne·s·cm—2，細(xì)胞培養(yǎng)基的動(dòng)態(tài)黏性系數(shù)可認(rèn)為約等于水;v為流體速度;y為層流距離底部邊界高度.

通過(guò)對(duì)(2)式進(jìn)行積分得到流體速度與流體剪切應(yīng)力的關(guān)系為

其中h為微流控芯片溝道高度.在已知生物體各個(gè)器官的流體剪切應(yīng)力的情況下，根據(jù)溝道的尺寸得出了在微流控系統(tǒng)中對(duì)應(yīng)的流量:

其中Q為微流控系統(tǒng)中的流體流量，A1為微流體溝道中流體流過(guò)的橫截面面積.

2.6 細(xì)胞培養(yǎng)

本文以人腸上皮細(xì)胞Caco-2 (ATCC，USA)為模式細(xì)胞探索太赫茲輻照對(duì)細(xì)胞的生物效應(yīng).Caco-2 細(xì)胞在75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)完成復(fù)蘇和擴(kuò)增，培養(yǎng)基為低糖DMEM (HyClone，SH-30021.01)，含有20%胎牛血清FBS (BI，04-001-1A)和1%的青霉素-鏈霉素(Solarbio，P1400).細(xì)胞在37 ℃和5% CO2的濕潤(rùn)條件下孵育直至覆蓋培養(yǎng)瓶表面70%，將細(xì)胞消化后接種至微流控芯片.在細(xì)胞接種至微流控芯片之前，先對(duì)芯片進(jìn)行清潔滅菌處理.簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，先用75%酒精灌注微流控溝道和連接管進(jìn)行清潔，在生物安全柜中用紫外燈滅菌后，用50 μg/mL 人類成纖維細(xì)胞纖連蛋白(Sigma-Aldrich，33016015)和100 μg/mL 大鼠來(lái)源的鼠尾膠原蛋白(Roche，11179179001)依次對(duì)溝道表面進(jìn)行包被.使用細(xì)長(zhǎng)低吸附移液槍頭(Rainin，30389291)將密度為5 × 106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液通過(guò)移液槍泵入到微流控溝道中，在培養(yǎng)箱中靜置3 h 使得細(xì)胞貼附，隨后分為靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng).靜態(tài)培養(yǎng)中，細(xì)胞貼附后每天進(jìn)行換液;動(dòng)態(tài)培養(yǎng)中，細(xì)胞貼附后使用注射泵(DK Infusetek Co.，ISPLab12)以與腸上皮的生理管腔應(yīng)力等同的流量(0.05 μL/s[17，18])向微流控溝道中灌注新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，動(dòng)態(tài)和靜態(tài)均持續(xù)培養(yǎng)4 天.

2.7 輻照條件

在植入細(xì)胞后的第二天開(kāi)始對(duì)微流控芯片進(jìn)行太赫茲輻照.太赫茲發(fā)射源(Terasense Sub-THz wave source，S/N:200382)放置于COP-PDMS 芯片底部1.5 cm 處.采用0.1 THz、實(shí)測(cè)平均功率密度為15 mW/cm2的太赫茲波對(duì)微流控芯片進(jìn)行輻照，每天輻照10 min，連續(xù)輻照3 天.在最后一次輻照后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，再進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞固定及免疫熒光染色.

2.8 免疫熒光染色

用3.7%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min 后，用體積濃度為0.1%的triton X100 (Solarbio，T8200)在室溫下滲透細(xì)胞10 min.用體積濃度為5% 的牛血清白蛋白 (Bioforxx，4240GR100)覆蓋芯片溝道，并在室溫下停留30 min 以阻斷非特異性蛋白的結(jié)合，洗去牛血清蛋白后加入鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的染料(Beyotime，C2207S)對(duì)細(xì)胞骨架微絲蛋白F-actin進(jìn)行染色，孵育時(shí)間為1 h.隨后加入1∶200 稀釋的一抗(細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1 (ProteinTech，66452-1-Ig)或樁蛋白Paxillin (ProteinTech，1002 9-1-Ig))，在4 ℃ 孵育過(guò)夜后加入1∶100 稀釋的二抗FITC (ProteinTech，SA00003-1)，在室溫下孵育1 h 后使用DAPI 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色.免疫熒光染色完成后，用共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 700)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像，記錄熒光強(qiáng)度和細(xì)胞核數(shù)，通過(guò)ImageJ 軟件對(duì)每個(gè)細(xì)胞中相應(yīng)種類蛋白的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析.

2.9 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)試的重復(fù)次數(shù)為n≥ 3.數(shù)據(jù)采用平均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示，特定情況單獨(dú)說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)組之間結(jié)果差異的顯著性分析采用單因素方差分析和t檢驗(yàn).為了避免統(tǒng)計(jì)上的出現(xiàn)I 型和II 型誤差增加，本文使用了Bonferroni 校正和霍爾姆法.統(tǒng)計(jì)分析通過(guò)Microsoft Excel 和Matlab 完成，p值小于0.05 時(shí)認(rèn)為結(jié)果具有顯著性差異.

3 結(jié)果與討論

3.1 COP 和PDMS 的太赫茲吸收率

通過(guò)對(duì)兩種材料的太赫茲吸收率的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PDMS 對(duì)太赫茲的吸收系數(shù)在低頻段時(shí)(小于1 THz)隨著太赫茲頻段上升而增加，而當(dāng)太赫茲頻率超過(guò)1 THz 后，PDMS 的吸收系數(shù)出現(xiàn)最高峰:約為20 cm—1(圖2).不同于PDMS 的吸收系數(shù)隨著太赫茲頻率變化而產(chǎn)生差異，在太赫茲頻段0.1—2.4 THz 范圍內(nèi)，COP 的吸收系數(shù)維持在0.01—1 cm—1(圖2)范圍內(nèi).該結(jié)果提示了COP對(duì)太赫茲的透過(guò)性高，對(duì)比其他常用高分子材料如PMMA，PET，PC，PS 和石英在該頻段范圍的吸收率[8，10，12，19]，COP 將會(huì)在未來(lái)太赫茲生物效應(yīng)的研究中發(fā)揮巨大作用.

圖2 兩種微流控材料—COP 和PDMS 在太赫茲頻段0.1—2.4 THz 范圍內(nèi)的吸收光譜Fig.2.The THz absorption map of two characteristic materials:COP and PDMS，between the frequency from 0.1 to 2.4 THz.

3.2 COP 等離子改性

COP 表面改性結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)等離子處理后，該COP 板材的表面被成功改性:未經(jīng)過(guò)改性的板材表面的超純水液滴呈現(xiàn)球狀，等離子改性后，超純水液滴在板子表面張力減小，呈現(xiàn)平鋪狀態(tài)(圖A2)，提示了改性后的COP 表面呈現(xiàn)親水性.PDMS 的等離子改性參數(shù)及結(jié)果在前期的工作中已經(jīng)完成[20].COP 和PDMS 表面均呈現(xiàn)親水性，代表了極性基團(tuán)的成功引入，理論上，其表面進(jìn)行脫水反應(yīng)后產(chǎn)生的化學(xué)鍵可以使兩種材料緊密黏合.

3.3 COP-PDMS 鍵合強(qiáng)度

通過(guò)推拉力計(jì)對(duì)COP-PDMS 的鍵合強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，完全剝離COP 和PDMS 模塊需要的剪切應(yīng)力從0.1 至0.6 MPa 不等(圖3(a)).根據(jù)目前已發(fā)現(xiàn)的PDMS 與其他材料的鍵合強(qiáng)度數(shù)據(jù)，PDMS 與石英的鍵合強(qiáng)度最大[21]，為0.33 MPa[22]至 0.497 MPa[23，24].COP-PDMS 鍵合強(qiáng)度的結(jié)果顯示，在外加壓強(qiáng)3750 和5000 Pa 時(shí)，對(duì)應(yīng)的剪切應(yīng)力分別為0.51 MPa 和0.56 MPa，均高于PDMS與石英的鍵合強(qiáng)度，證明了額外加壓后，COP-PDMS能夠達(dá)到與PDMS-石英同樣甚至更高強(qiáng)度的鍵合效果.該研究結(jié)果還顯示，不同加壓條件下鍵合的COP-PDMS 的強(qiáng)度與壓強(qiáng)呈正相關(guān)關(guān)系(圖3(b)).在壓強(qiáng)較低時(shí)(低于750 Pa)，加壓與鍵合強(qiáng)度的正相關(guān)關(guān)系坡度較陡，提示了在低壓條件下，加壓對(duì)增加鍵合強(qiáng)度的效果更明顯;而加壓高于750 Pa時(shí)，加壓與鍵合強(qiáng)度的正相關(guān)關(guān)系的坡度變緩，這是緣于加壓后PDMS 與COP 增加的接觸面積有限且兩種材料表面互相反應(yīng)的極性基團(tuán)的數(shù)量逐漸被飽和.

圖3 (a) 鍵合過(guò)程加壓后(0 至5000 Pa) COP-PDMS 微流控芯片的鍵合強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果，鍵合強(qiáng)度代表的是完全剝離兩種材料需要的剪切應(yīng)力，該剪切應(yīng)力通過(guò)推拉力計(jì)測(cè)量得出;(b) 芯片鍵合強(qiáng)度與額外加壓的對(duì)應(yīng)關(guān)系;(c) 高灌注速率(200 μL/s)下溝道變形及密封度變化情況;(d) 2 周長(zhǎng)時(shí)程動(dòng)態(tài)灌注(灌注速率為0.05 μL/s)后溝道形變及密封度變化情況Fig.3.(a) Bonding strength test results of COP-PDMS microfluidic device with the vary compressions (0 to 5000 Pa) during the bonding process.The bonding strength represents the shear stress required for completely stripping two materials，which is measured by push-tension meter.(b) The corresponding relationship between the bonding strength of microfluidic device and the compressions during the bonding process.(c) The seal and deformation change of channels and chamber at high fluid perfusion rate(200 μL/s).(d) The seal and deformation change of channels and chamber after a 2-week time-course dynamic perfusion (0.05 μL/s).

3.4 COP-PDMS 微流控芯片高灌注量和長(zhǎng)時(shí)程檢測(cè)

由于PDMS-石英鍵合的微流控芯片的強(qiáng)度和密封性的優(yōu)勢(shì)，其在體外細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用廣泛，而在本研究中鍵合的COP-PDMS 微流控芯片強(qiáng)度能夠達(dá)到同樣的水平，為了驗(yàn)證該芯片同樣可以用于體外細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)一步進(jìn)行了COP-PDMS 微流控芯片液體高灌注量和長(zhǎng)時(shí)程檢測(cè)以確定其在不同細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用的穩(wěn)定性.本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)鍵合強(qiáng)度結(jié)果，COP-PDMS 芯片的鍵合條件為表面加壓5000 Pa.基于微流控溝道的設(shè)計(jì)參數(shù)，計(jì)算出了在COP-PDMS 微流控芯片中模擬生物體內(nèi)各個(gè)器官組織的流體剪切應(yīng)力所需要的流量(表1).根據(jù)計(jì)算結(jié)果，采用對(duì)應(yīng)的流量對(duì)上述芯片溝道的密封性、完整性進(jìn)行了測(cè)試.參考表1 中的結(jié)果，用于測(cè)試的流體流量為0.05，0.1，0.2，0.4，1，2，5，10，50，100，150，200 μL/s.測(cè)試結(jié)果表示，200 μL/s及以下的流量產(chǎn)生的剪切應(yīng)力均不會(huì)對(duì)COPPDMS 微流控芯片的溝道產(chǎn)生形變且不會(huì)使兩種材料剝離(圖3(c)).長(zhǎng)時(shí)程檢測(cè)的結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)2 周、流量為模擬腸腔生物剪切應(yīng)力的0.05 μL/s的灌注后，COP-PDMS 芯片的溝道形狀、密封性均未發(fā)生變化.該結(jié)果證明，該COP-PDMS 微流控芯片的鍵合條件能夠模擬各個(gè)器官體內(nèi)的生物剪切應(yīng)力，并能夠在長(zhǎng)時(shí)間的灌注下保持形狀和密封性不變，從而滿足后續(xù)的生物實(shí)驗(yàn).

表1 生物體內(nèi)各個(gè)組織器官中的流體剪切應(yīng)力及在COP-PDMS 微流控芯片中模擬對(duì)應(yīng)流體剪切應(yīng)力需要的流體流量Table 1. Shearing stress in the in-vivo tissues and the corresponding fluidic perfusion rate in the COP-PDMS microfluidic device to simulate the shearing stress.

3.5 COP-PDMS 微流控芯片中的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)

將腸上皮細(xì)胞Caco-2 接種至COP-PDMS 微流控芯片后，首先對(duì)比了短期靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)后細(xì)胞的貼附生長(zhǎng)情況，驗(yàn)證了在該微流控芯片中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞能夠更近似地模擬體內(nèi)環(huán)境中的細(xì)胞，表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞能夠表達(dá)更多的細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1 和細(xì)胞骨架微絲蛋白F-actin (圖A3(a)).ZO-1 蛋白表達(dá)量是腸上皮細(xì)胞的一項(xiàng)重要特征，也是判斷腸上皮細(xì)胞之間是否形成緊密連接的重要依據(jù).從熒光染色結(jié)果來(lái)看，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞間的ZO-1 表達(dá)出連續(xù)的熒光，且熒光強(qiáng)度高于靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞.相比于傳統(tǒng)腸上皮細(xì)胞的3 周靜態(tài)培養(yǎng)模型以獲得細(xì)胞極化和胞間緊密連接，該結(jié)果提示了動(dòng)態(tài)流體灌注產(chǎn)生的生物剪切應(yīng)力能夠快速促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的極化，從而促使細(xì)胞在短時(shí)間合成大量的ZO-1，快速形成胞間緊密連接，這一結(jié)果與已報(bào)道的PDMS 與其他材料鍵合后形成的微流控芯片的結(jié)果一致[33-36].微絲蛋白F-actin 不僅能夠作為細(xì)胞支架，還參與細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和信號(hào)傳導(dǎo).我們發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下的細(xì)胞的骨架表現(xiàn)出了一定的延展性，且F-actin 的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，提示了在動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的生物剪切應(yīng)力能夠促進(jìn)細(xì)胞中微絲蛋白間的分子相互作用，從而促進(jìn)微絲蛋白的組裝，這一發(fā)現(xiàn)也在其他類型的微流控芯片中被報(bào)道[37，38].與細(xì)胞黏附和遷移有關(guān)的樁蛋白Paxillin在兩種培養(yǎng)條件下也表現(xiàn)出顯著性差異(圖A3(b))，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下的細(xì)胞表達(dá)出更高的Paxillin，提示了生物剪切應(yīng)力在細(xì)胞黏附方面起到了促進(jìn)作用，這一發(fā)現(xiàn)與前期報(bào)道的剪切應(yīng)力可促進(jìn)Paxillin 表達(dá)的結(jié)果一致[39，40].基于這些發(fā)現(xiàn)，我們?cè)诤罄m(xù)太赫茲生物效應(yīng)的研究中選用了動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模型.

3.6 太赫茲輻照對(duì)細(xì)胞的生物效應(yīng)

將在COP-PDMS 微流控芯片中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的Caco-2 細(xì)胞經(jīng)0.1 THz 每日輻照10 min，輻照3 天后進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，檢測(cè)Caco-2 細(xì)胞中ZO-1，Paxillin 和F-actin 的表達(dá)及分布(圖4(a)和圖4(b)).從F-actin 染色的圖片上可以看出，未進(jìn)行太赫茲輻照的細(xì)胞表現(xiàn)出舒展、向外擴(kuò)散的形態(tài)，細(xì)胞邊緣規(guī)則光滑;而經(jīng)太赫茲輻照后Caco-2細(xì)胞有一定程度的收縮，游離的未與其他細(xì)胞接觸的邊緣呈一定的毛刺狀，提示太赫茲輻照后的腸上皮細(xì)胞與培養(yǎng)介質(zhì)可能發(fā)生貼附減弱的現(xiàn)象.從Factin 的表達(dá)水平上看(圖4(c))，輻照后的F-actin蛋白量并未顯著改變，但可以從圖中看出，太赫茲輻照的Caco-2 細(xì)胞中F-actin 形成的纖維狀結(jié)構(gòu)減少.Yamazaki 等[5]前期報(bào)道了太赫茲輻射能夠影響細(xì)胞微絲蛋白Actin 的聚合，本文在細(xì)胞中觀察到了太赫茲輻照后細(xì)胞內(nèi)F-actin 聚集形態(tài)的變化，進(jìn)一步提示太赫茲可能對(duì)細(xì)胞內(nèi)Actin 蛋白間的相互作用具有調(diào)控作用.

圖4 太赫茲輻照對(duì)COP-PDMS 微流控芯片中動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的Caco-2 細(xì)胞的ZO-1，Paxillin 和F-actin 的免疫熒光檢測(cè)(圖中基準(zhǔn)尺為20 μm) (a) ZO-1 與F-actin 的免疫熒光染色;(b) Paxillin 與F-actin 的免疫熒光染色;(c) 對(duì)(a)和(b)圖中太赫茲輻照前后ZO-1，Paxillin 和F-actin 免疫熒光強(qiáng)度定量分析結(jié)果(t 檢驗(yàn)顯著性差異:p ＜ 0.05，*;p ＜ 0.01，**)Fig.4.Immunofluorescence staining results of Caco-2 cells that are dynamically cultured in COP-PDMS microfluidic device，before and after terahertz irradiation (scale bar:20 μm).(a) The confocal result of ZO-1 and F-actin.(b) The confocal result of Paxillin and F-actin.(c) Quantitative analysis of immunofluorescence intensity of ZO-1，Paxillin and F-actin of the cells in panel (a) and (b):The quantification is determined as immunofluorescence intensity corresponding to 104 nuclei (significance of t-test:p ＜ 0.05，*;p ＜ 0.01，**).

對(duì)Caco-2 細(xì)胞中ZO-1 的免疫熒光染色結(jié)果顯示，未經(jīng)輻照的Caco-2 細(xì)胞中ZO-1 在細(xì)胞膜表面特別是相鄰細(xì)胞相互接觸的細(xì)胞膜界面上表現(xiàn)出較亮和較粗的熒光;而在太赫茲輻照后的Caco-2 細(xì)胞中，ZO-1 在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)彌散樣分布，其在細(xì)胞膜上的定位不明顯.對(duì)ZO-1 熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，輻照后的腸上皮細(xì)胞ZO-1 的水平是未經(jīng)太赫茲輻照細(xì)胞的4 倍.這些結(jié)果顯示太赫茲輻照可以改變Caco-2 細(xì)胞中胞間緊密連接蛋白ZO-1 在細(xì)胞內(nèi)的分布，促進(jìn)ZO-1 蛋白水平的升高，提示太赫茲能夠?qū)?xì)胞緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響.此外，對(duì)樁蛋白Paxillin 的免疫熒光檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，太赫茲輻照后的Caco-2 細(xì)胞中Paxillin 的熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，且部分細(xì)胞中Paxillin出現(xiàn)了局部聚集分布的現(xiàn)象(圖4(b))，這一結(jié)果提示太赫茲輻照可以提高Paxillin 蛋白的水平，且對(duì)細(xì)胞與基質(zhì)的黏附產(chǎn)生的影響.

綜合上述結(jié)果，我們認(rèn)為0.1 THz 輻照可能會(huì)減弱細(xì)胞外及細(xì)胞間的黏附作用，推測(cè)ZO-1 與Paxillin 蛋白水平的升高則可能是細(xì)胞應(yīng)對(duì)黏附作用降低的一種代償性反應(yīng)，進(jìn)一步詳細(xì)的機(jī)制仍需要更深入的實(shí)驗(yàn)研究.

4 結(jié)論

本文開(kāi)發(fā)了新的COP 與PDMS 鍵合方法，設(shè)計(jì)并制備了適用于太赫茲細(xì)胞水平生物效應(yīng)研究的COP-PDMS 微流控芯片.該鍵合方法制備的COP-PDMS 微流控芯片黏合強(qiáng)度和密封性均能達(dá)到與目前常用的微流控材料的相同水平，并且在瞬時(shí)高灌注量和長(zhǎng)時(shí)程灌注檢測(cè)中，能保持溝道無(wú)形變且密封性完好，可用于體外細(xì)胞的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)、太赫茲輻照處理及進(jìn)一步的激光共聚焦顯微鏡觀察，為太赫茲細(xì)胞水平生物效應(yīng)的研究提供了便利的條件.基于該芯片開(kāi)展了腸上皮細(xì)胞Caco-2 的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)及0.1 THz 對(duì)細(xì)胞黏附功能影響的研究，發(fā)現(xiàn)0.1 THz 可引起腸上皮細(xì)胞胞間緊密連接蛋白ZO-1 和樁蛋白Paxillin 的水平升高及細(xì)胞黏附狀態(tài)的改變，提示輻照可能會(huì)減弱細(xì)胞外及細(xì)胞間的黏附作用.基于本研究制備的COP-PDMS 微流控芯片，未來(lái)可以進(jìn)一步開(kāi)展0.1 THz 對(duì)細(xì)胞黏附功能影響的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，以深入揭示其作用的過(guò)程和分子機(jī)制.

感謝青島青源峰達(dá)太赫茲科技有限公司在COP 和PDMS 樣片太赫茲吸收率檢測(cè)中的幫助;感謝西安電子工程研究所石東辰老師在推拉力計(jì)建模、軟件調(diào)試和測(cè)試中的幫助;感謝西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院許丹老師提供的Caco-2 細(xì)胞.

附錄A 微流控芯片設(shè)計(jì)、等離子處理及細(xì)胞培養(yǎng)的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

圖A1 給出了微流控芯片溝道設(shè)計(jì)CAD 圖及設(shè)計(jì)參數(shù).圖A2 為COP 材料等離子改性前后親水性測(cè)試，測(cè)試結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)發(fā)射功率為150 W，時(shí)間為60 s 的等離子處理后，COP 材料表面呈現(xiàn)明顯的親水性:滴落在表面的液滴由未處理前的球狀變?yōu)槠戒仩?圖A3給出了在COPPDMS 微流控芯片中動(dòng)態(tài)和靜態(tài)培養(yǎng)中，Caco-2 細(xì)胞的ZO-1，Paxillin 和F-actin 的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果.結(jié)果顯示，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)下的腸道細(xì)胞可被快速極化，形成緊密連接結(jié)構(gòu)，并呈現(xiàn)與靜態(tài)培養(yǎng)不同的細(xì)胞形態(tài).

圖A1 微流控芯片溝道設(shè)計(jì)CAD 圖及設(shè)計(jì)參數(shù)Fig.A1.CAD drawing and design parameters of the channel design of microfluidic chip.

圖A2 COP 材料等離子改性前后親水性測(cè)試Fig.A2.Hydrophilicity test of COP material before and after plasma modification.

圖A3 在COP-PDMS 微流控芯片中動(dòng)態(tài)和靜態(tài)培養(yǎng)中，Caco-2 細(xì)胞的ZO-1，Paxillin 和F-actin 的免疫熒光檢測(cè)(圖中基準(zhǔn)尺為20 μm) (a) ZO-1 與F-actin 的免疫熒光染色;(b) Paxillin 與F-actin 的免疫熒光染色;(c) 對(duì)(a)和(b)圖中太赫茲輻照前后ZO-1，Paxillin 和F-actin 免疫熒光強(qiáng)度定量分析結(jié)果(t 檢驗(yàn)顯著性差異:p ＜ 0.05，*;p ＜ 0.01，**)Fig.A3.Immunofluorescence staining results of Caco-2 cells that are dynamically and statically cultured in COP-PDMS microfluidic device (scale bar:20 μm).(a) The confocal result of ZO-1 and F-actin.(b) The confocal result of Paxillin and F-actin.(c) Quantitative analysis of immunofluorescence intensity of ZO-1，Paxillin and F-actin of the cells in panel (a) and (b):The quantification is determined as immunofluorescence intensity corresponding to 104 nuclei (significance of t-test:p ＜ 0.05，*;p ＜ 0.01，**).