肖京林，覃 美，楊 曙，易 科，黎曉峰，唐新蓮，凌桂芝

(1.廣西甘蔗生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】土壤重金屬污染是全球面臨的重大環(huán)境污染之一，鎘(Cd)是我國(guó)土壤中的主要污染元素[1]。Cd污染會(huì)造成植物葉片失綠發(fā)黃、植株矮化[2]，抑制根系伸長(zhǎng)，引起根系萎爛發(fā)黑，甚至導(dǎo)致植物死亡[3]，Cd還會(huì)通過(guò)食物鏈影響人體健康[4]。甘蔗是我國(guó)重要的熱帶作物，也是廣西地區(qū)第一大戰(zhàn)略性經(jīng)濟(jì)作物[5]，對(duì)Cd具有較強(qiáng)的生理耐性，能在Cd污染地區(qū)種植，但生產(chǎn)上甘蔗幼苗常出現(xiàn)Cd毒害導(dǎo)致的黃化甚至枯死現(xiàn)象，最終導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量降低，而有關(guān)Cd對(duì)甘蔗生長(zhǎng)影響的研究多集中在甘蔗伸長(zhǎng)期和成熟期的Cd吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和積累特點(diǎn)等方面[6]，對(duì)易發(fā)生Cd毒害的甘蔗幼苗在CdCl2脅迫下的Cd吸收積累、分配及細(xì)胞壁固定Cd的解毒機(jī)制等并未深入探討。因此，探究CdCl2脅迫下甘蔗幼苗根系細(xì)胞壁的Cd積累特點(diǎn)及Cd耐性機(jī)制，對(duì)在土壤Cd超標(biāo)區(qū)域推廣種植甘蔗新品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】Wang等[7]研究認(rèn)為，當(dāng)土壤Cd濃度達(dá)233.00 mg/kg時(shí)甘蔗產(chǎn)量?jī)H相對(duì)降低13.6%，因此，甘蔗在Cd污染土壤上種植潛力較大。刀靜梅等[8]研究甘蔗Cd積累特征發(fā)現(xiàn)，Cd在甘蔗地下部富集量較大，在地上部富集量較小，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均小于1.000。曾巧英等[9]研究表明，耐Cd甘蔗品種能保持較高生長(zhǎng)量的原因可能是通過(guò)降低Cd向地上部分轉(zhuǎn)移，使更多Cd積累在根系從而緩解Cd毒害。根系是植物最初接觸Cd的部位，其細(xì)胞壁中的多糖組分因含帶負(fù)電荷的羧基、羥基和氨基等基團(tuán)而具有重金屬陽(yáng)離子結(jié)合能力[10]，減少進(jìn)入細(xì)胞的重金屬量，使植物表現(xiàn)對(duì)Cd脅迫具有耐受性[11]。朱秀紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，油菜根部和葉部細(xì)胞壁Cd所占比例隨著Cd脅迫濃度的增加而增加。劉仲齊等[13]研究認(rèn)為，水稻能夠?qū)⒋罅康腃d固定在營(yíng)養(yǎng)體的細(xì)胞壁中，只有極少數(shù)的Cd運(yùn)輸?shù)剿胼S，從而緩解Cd毒害。張虹等[14]利用FTIR分析小飛蓬根和葉細(xì)胞壁上Cd 吸附位點(diǎn)的官能團(tuán)，發(fā)現(xiàn)在小飛蓬根和葉細(xì)胞壁吸附Cd的過(guò)程中，羥基、羧基和氨基都是Cd的主要結(jié)合位點(diǎn)，而果膠主要提供羥基官能團(tuán)與Cd相結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，果膠的甲酯化程度影響其對(duì)Cd的結(jié)合，如Colzi等[15]研究顯示，亞麻下胚軸細(xì)胞壁中低甲酯化的果膠是Cd的主要結(jié)合位，甲酯化程度越低的果膠結(jié)合Cd能力越強(qiáng)。郭軍康等[16]對(duì)不同年限設(shè)施菜地番茄細(xì)胞壁果膠Cd累積的研究發(fā)現(xiàn)，莖和葉片中果膠含量及果膠甲酯酶(PME)活性與細(xì)胞壁Cd累積量呈正相關(guān)?？梢?jiàn)，Cd脅迫植物時(shí)其細(xì)胞壁能通過(guò)吸附固定Cd而減少Cd向胞內(nèi)運(yùn)輸，提高植株對(duì)Cd的耐受性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)甘蔗幼苗Cd積累、分布和Cd解毒機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以新培育的兩個(gè)高產(chǎn)甘蔗品種中蔗1號(hào)和中蔗6號(hào)為試驗(yàn)材料開(kāi)展CdCl2脅迫水培試驗(yàn)，探究其幼苗中Cd的分布特點(diǎn)及其根系細(xì)胞壁在CdCl2脅迫下的解毒機(jī)制，為高產(chǎn)甘蔗新品種在Cd污染土壤上推廣種植提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中蔗1號(hào)(Z1)和中蔗6號(hào)(Z6)是由廣西大學(xué)培育提供、具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)量大和高產(chǎn)等特點(diǎn)的甘蔗新品種，參照武欣等[17]的方法在溫室中育苗和培育。脅迫所用Cd為CdCl2，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CdCl2脅迫對(duì)甘蔗幼苗根系、葉片和根系細(xì)胞壁Cd含量及細(xì)胞壁多糖組分的影響 選取15 d日齡、1心4葉的Z1幼苗分別置于含0(對(duì)照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2溶液中培養(yǎng)4 d后，以0.5 mmol/L CaCl2溶液浸泡根系30 min，洗脫附著在根系表面的Cd。Z1幼苗經(jīng)去離子水清洗根系后，采集根系和葉片，分別測(cè)定其Cd含量；稱(chēng)取5.0 g鮮樣根系，提取細(xì)胞壁后全部烘干并稱(chēng)重，測(cè)定鮮樣根系和烘干根系細(xì)胞壁的Cd含量，計(jì)算根系中的Cd和細(xì)胞壁中的Cd積累量及根系中細(xì)胞壁Cd的積累量占比；提取根系細(xì)胞壁烘干并分離細(xì)胞壁的果膠和半纖維組分[半纖維素I(HCI)和半纖維素II(HCII)]，測(cè)定果膠和半纖維素含量及果膠甲脂化程度，計(jì)算去甲酯化果膠含量并測(cè)定Cd含量。剪取1.0 cm根尖，用于PME活性(nmol H+/min)測(cè)定。3次重復(fù)。

1.2.2 CdCl2脅迫對(duì)甘蔗種莖初生根相對(duì)伸長(zhǎng)率和根系活力的影響 選取3 d日齡、初生根長(zhǎng)勢(shì)均勻的Z1和Z6種莖，分別置于含0(對(duì)照)、1.0、2.0、5.0 μmol/L(低濃度)和10.0、20.0、50.0、100.0 μmol/L(高濃度)CaCl2溶液中培養(yǎng)。每個(gè)種莖為1個(gè)重復(fù)，設(shè)12個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)0和24 h后利用直尺分別量取根長(zhǎng)，計(jì)算根的相對(duì)伸長(zhǎng)率；剪取1.0 cm根尖，用氯化三苯四唑(TTC)還原量法測(cè)定低濃度CdCl2脅迫下的根系活力，計(jì)算TTC還原量[μg/(kg·h)]代表根系活力。

1.2.3 CdCl2脅迫對(duì)甘蔗幼苗Cd吸收和積累的影響 選取15 d日齡Z1和Z6幼苗分別置于含0(對(duì)照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CaCl2溶液中培養(yǎng)，4 d后以0.5 mmol/L CaCl2溶液浸泡幼苗根系30 min，洗脫附著在根系表面的Cd并采集幼苗根系、葉片和葉鞘，擦拭水分后稱(chēng)量各部分重量，測(cè)定各部分的Cd含量，計(jì)算地上部(葉片和葉鞘)和地下部(根系)的Cd含量并計(jì)算其比值。3次重復(fù)。地上部Cd含量=(葉片Cd含量×葉片重量+葉鞘Cd含量×葉鞘重量)/(葉片重量+葉鞘重量)。

選取3 d日齡、初生根長(zhǎng)勢(shì)均勻的Z1和Z6種莖，分別置于含0(對(duì)照)、1.0、2.0和5.0 μmol/L CaCl2溶液中培養(yǎng)4 d后，剪取1.0 cm根尖，測(cè)定Cd含量。剪取根尖提取細(xì)胞壁，并分離根尖細(xì)胞壁的果膠和半纖維組分，測(cè)定其Cd含量。

上述Cd培養(yǎng)液的pH均為5.5，采用通氣泵通氣補(bǔ)氧，每1 h通氣15 min。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

根系活力參照張志勇等[18]的TTC還原量法(方法一中的熱提法)進(jìn)行測(cè)定；細(xì)胞壁及其多糖組分的提取和分離、果膠甲酯酶活性、果膠甲酯化程度及細(xì)胞汁液和殘?jiān)姆蛛x均參照Yang等[19]的方法進(jìn)行操作或測(cè)定；Cd含量參照GB 5009.15—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中Cd的測(cè)定》[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。

根的相對(duì)伸長(zhǎng)率(%)=不同濃度Cd處理24 h后的根長(zhǎng)/對(duì)照24 h后的根長(zhǎng)×100

Cd處理24 h后的根長(zhǎng)=Cd處理24 h后測(cè)量的根長(zhǎng)-Cd處理0 h測(cè)量的根長(zhǎng)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行整理，以Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗幼苗的Cd積累特征

從表1可看出，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理15 d日齡幼苗4 d后，其葉片的Cd含量分別為0.79、1.09和1.25 mg/kgFW，均顯著高于對(duì)照(P<0.05，下同)，根系的Cd含量分別為107.20、134.90和145.20 mg/kgFW，顯著高于對(duì)照，分別約為葉片Cd含量的136、124和116倍?？梢?jiàn)，甘蔗幼苗根系對(duì)進(jìn)入其體內(nèi)的Cd具有很強(qiáng)的截留能力。

CdCl2處理15 d日齡Z1幼苗4 d后，隨著脅迫濃度的提高，其根系細(xì)胞壁的Cd在根系中占比也顯著增加，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理幼苗根系細(xì)胞壁的Cd占比分別為35.80%、44.10%和57.50%?？梢?jiàn)，隨著CdCl2脅迫濃度的提高，更多的Cd被根系細(xì)胞壁所固定積累。

1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理15 d日齡Z1幼苗4 d后，其根系細(xì)胞壁中的Cd均有95.00%以上累積在果膠和半纖維素組分中。其中，半纖維素組分中的Cd含量占比隨著CdCl2濃度的提高而顯著降低，但CdCl2濃度為5.0 μmol/L時(shí)半纖維素組分中的Cd含量占比仍達(dá)60.27%，而果膠組分中的Cd含量占比(分別為18.71%、28.52%和36.28%)隨著CdCl2濃度的提高而顯著升高?？梢?jiàn)，甘蔗根系細(xì)胞壁中的果膠和半纖維素均為積累Cd的主要組分，且隨著CdCl2脅迫濃度的提高，果膠中的Cd含量占比顯著增加。

2.2 CdCl2脅迫對(duì)甘蔗幼苗根系細(xì)胞壁及其多糖組分的影響

為了解甘蔗幼苗根系細(xì)胞壁固定Cd的機(jī)制，需對(duì)CdCl2脅迫1心4葉甘蔗幼苗4 d后的根系細(xì)胞壁果膠和半纖維素含量、果膠PME活性和果膠甲酯化程度進(jìn)行分析。由表2可知，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1幼苗根系細(xì)胞壁的半纖維素I(HCI)和半纖維素II(HCII)含量間無(wú)顯著差異，但其果膠含量和PME活性均顯著高于對(duì)照，果膠的甲酯化程度均顯著低于對(duì)照，而去甲酯化果膠含量均顯著高于對(duì)照。可見(jiàn)，CdCl2脅迫下Z1幼苗根系細(xì)胞壁中的果膠組分含量增加及PME催化的果膠甲酯化程度降低，導(dǎo)致Cd在果膠中積累增加，根系細(xì)胞壁對(duì)Cd的積累量相應(yīng)增加，減少了Cd向胞內(nèi)運(yùn)輸，最終使得更多的Cd被截留在根系中從而減少向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。

表1 CdCl2脅迫對(duì)Z1幼苗Cd含量的影響

表2 Cd對(duì)甘蔗根系細(xì)胞壁組分含量及果膠PME活性、去甲酯化程度和去甲酯化果膠含量的影響

2.3 CdCl2脅迫對(duì)蔗種初生根相對(duì)伸長(zhǎng)率和根系活力的影響

從圖1-A可看出，CdCl2處理24 h后，Z1和Z6種莖的初生根伸長(zhǎng)率均隨著脅迫濃度的提高而顯著下降，1.0、2.0和5.0 μmol/L低濃度CdCl2處理種莖初生根的伸長(zhǎng)率分別為對(duì)照的90.7%和85.1%、87.2%和77.16%及67.6%和64.7%，其中，5.0 μmol/L CdCl2處理種莖初生根的伸長(zhǎng)受抑制程度最重；Z1和Z6種莖初生根的相對(duì)伸長(zhǎng)率間無(wú)顯著差異(P>0.05，下同)，說(shuō)明Z1和Z6種莖的初生根對(duì)低濃度CdCl2的耐受性相似。10.0、20.0、50.0 μmol/L高濃度CdCl2處理種莖初生根的伸長(zhǎng)率分別為對(duì)照的41.1%和43.7%、33.6%和30.8%及19.2%和18.1%，且差異顯著，而50.0和100.0 μmol/L CdCl2處理種莖的初生根伸長(zhǎng)率差異不顯著，但二者均顯著低于10.0和20.0 μmol/L CdCl2處理?？梢?jiàn)，不同濃度CdCl2脅迫均顯著抑制甘蔗種莖根的伸長(zhǎng)，其中，低CdCl2濃度中的5.0 μmol/L脅迫時(shí)根伸長(zhǎng)的受抑制程度最高重，高CdCl2濃度中的50.0 μmol/L脅迫時(shí)根系幾乎已停止伸長(zhǎng)。

從圖1-B可看出，低濃度CdCl2處理24 h后，Z1和Z6種莖初生根的根尖活力均隨著脅迫濃度的提高而下降，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理種莖初生根的根尖活力分別為對(duì)照的83.5%和86.1%、77.5%和80.0%及42.4%和42.7%。其中，5.0 μmol/L CdCl2處理Z1和Z6種莖的根尖活力僅分別為283.3和279.6 μg/(kg·h)，且均顯著低于對(duì)照及1.0和2.0 μmol/L CdCl2處理?？梢?jiàn)，低濃度CdCl2脅迫可顯著抑制甘蔗種莖的根尖活力。

在同一小圖中，圖柱上不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)In the same small graph，different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05)圖1 不同濃度CdCl2脅迫對(duì)甘蔗種莖初生根相對(duì)伸長(zhǎng)率(A)和根系活力(B)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CdCl2 stress on relative elongation of primary root(A) and root activity of sugarcane seed stems(B)

表3 CdCl2脅迫下的甘蔗幼苗Cd含量比較

綜上所述，甘蔗種莖的初生根對(duì)CdCl2脅迫十分敏感，低濃度的CdCl2脅迫即可顯著抑制其伸長(zhǎng)和降低其根尖活力。

2.4 CdCl2脅迫對(duì)甘蔗幼苗Cd吸收和積累的影響

由表3可知，2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1根系的Cd含量分別為135.20和145.40 mg/kgFW，葉片的Cd含量分別為1.12和1.54 mg/kgFW，葉鞘的Cd含量分別為1.79和3.48 mg/kg FW，均顯著高于Z6?？梢?jiàn)，CdCl2脅迫下Z1植株較Z6更容易累積Cd。

分析地下部Cd含量與地上部Cd含量的比值可反映植株體內(nèi)Cd向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的差異。從表3可看出，2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1和Z6幼苗地下部Cd含量與地上部Cd含量的比值均相近，相互間無(wú)顯著差異，而5.0 μmol/L CdCl2處理Z1和Z6幼苗地下部與地上部Cd含量的比值均顯著小于2.0 μmol/L CdCl2處理?？梢?jiàn)，雖然Z1和Z6幼苗根系和葉片的Cd含量存在顯著差異，但其體內(nèi)Cd向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)并無(wú)顯著差異，因此甘蔗幼苗吸收Cd的差異不是由Cd向地上部運(yùn)輸?shù)牟町愃隆?/p>

從表4可看出，不同濃度CdCl2處理3 d日齡Z1和Z6種莖4 d后，其根尖的Cd含量隨著CdCl2脅迫濃度的提高而升高，且1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1種莖根尖的Cd含量均顯著高于Z6；種莖根尖細(xì)胞壁的Cd含量和果膠中Cd的積累量均隨著CdCl2脅迫濃度的提高而升高，但1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理Z1和Z6種莖根尖細(xì)胞壁的Cd含量間和果膠中Cd的積累量間均無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，在CdCl2脅迫下Z1種莖根尖中的Cd含量與Z6存在顯著差異，但該差異不是細(xì)胞壁對(duì)Cd的結(jié)合能力不同所導(dǎo)致。

3 討 論

Cd不是植物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素，Cd脅迫會(huì)直接影響植物根系生長(zhǎng)，對(duì)植物產(chǎn)生毒害效應(yīng)[21]。大量研究表明，植物根系對(duì)Cd脅迫十分敏感，Cd脅迫會(huì)抑制水稻根系生長(zhǎng)，低濃度的Cd即可致使水稻根系生物量下降22.95%[22]；Cd脅迫會(huì)抑制煙草根系伸長(zhǎng)和側(cè)根萌發(fā)，并使根尖細(xì)胞老化死亡[23]。本研究中，甘蔗種莖的初生根對(duì)CdCl2脅迫十分敏感，低濃度(1.0～5.0 μmol/L)CdCl2脅迫僅處理1 d即可顯著抑制Z1和Z6幼苗根的伸長(zhǎng)，其中CdCl2濃度為5.0 μmol/L時(shí)根的伸長(zhǎng)受抑制程度最重；低濃度(1.0～5.0 μmol/L)CdCl2脅迫也會(huì)顯著抑制甘蔗種莖的根尖活力；Z1幼苗的Cd含量顯著高于Z6。因此推測(cè)，Z1對(duì)其體內(nèi)Cd毒害的忍耐能力較強(qiáng)，Z1相對(duì)于Z6更適合在Cd污染地區(qū)推廣種植。

細(xì)胞壁是植物體內(nèi)積累Cd的主要部位[24]。董萌等[25]研究表明，蔞蒿根系吸收的Cd有59%被細(xì)胞壁所固定，從而減少向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，減輕毒害作用。本研究發(fā)現(xiàn)，1.0 μmol/L CdCl2脅迫時(shí)，甘蔗幼苗根系中35.80%的Cd積累在細(xì)胞壁組分中，隨著CdCl2處理濃度的提高根系細(xì)胞壁中的Cd含量占比增加，CdCl2脅迫濃度為5.0 μmol/L時(shí)根系中的Cd有57.50%被細(xì)胞壁所吸附積累。因此推測(cè)，CdCl2脅迫下甘蔗幼苗根系細(xì)胞壁通過(guò)吸附和固定大量的Cd從而減少Cd向胞內(nèi)運(yùn)輸，使得更多的Cd被截留在根系中，減少向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，可緩解Cd對(duì)甘蔗幼苗的毒害程度。

表4 甘蔗種莖根尖及其細(xì)胞壁果膠中Cd的積累量比較

果膠和半纖維素是細(xì)胞壁上Cd的主要結(jié)合位點(diǎn)。在本研究中，甘蔗幼苗根系細(xì)胞壁中有超過(guò)60.00%的Cd位于半纖維素組分中，與雷麗萍等[26]研究發(fā)現(xiàn)植物中的Cd主要結(jié)合在半纖維素上的結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)，1.0、2.0和5.0 μmol/L CdCl2處理后，甘蔗幼苗根系細(xì)胞壁中的Cd僅18.71%～36.28%結(jié)合在果膠上，隨著CdCl2脅迫濃度的提高，Cd在果膠中的積累量顯著升高，說(shuō)明果膠對(duì)抵御Cd進(jìn)入細(xì)胞也具有重要作用；在CdCl2脅迫下，根系細(xì)胞壁果膠的PME活性提高，果膠的甲酯化程度降低，并促進(jìn)果膠組分含量增加，增加果膠對(duì)Cd的積累量，提高根系細(xì)胞壁對(duì)Cd的結(jié)合能力，最終使得根系的Cd積累增加，與代晶晶[27]對(duì)油菜、徐劼和保積慶[28]對(duì)芹菜、Colzi等[29]對(duì)石竹的研究結(jié)果相似?？梢?jiàn)，植物細(xì)胞壁中果膠的積累及其去甲酯化修飾可能有利于增加甘蔗細(xì)胞壁對(duì)Cd的結(jié)合能力。

4 結(jié) 論

在CdCl2脅迫下，甘蔗幼苗根系的細(xì)胞壁是Cd積累的主要部位；CdCl2脅迫會(huì)使甘蔗根系細(xì)胞壁果膠組分含量增加，PME活性升高，果膠甲酯化程度降低，細(xì)胞壁對(duì)Cd的結(jié)合能力提高，使得更多的Cd被根系細(xì)胞壁所固定，從而減少Cd向胞內(nèi)運(yùn)輸和地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。