崔芙巖，黃金月，姜佳欣，唐檬，馬鷹，鄭時嘉，于純淼，王志剛，楊波*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天問山農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150300)

黃精為常用中藥，在我國用藥歷史悠久，具有多種藥理作用，長期應用于治療肺虛燥咳、體倦乏力、腎虛虧損等，也應用于治療糖尿病、慢性肝炎、結(jié)核病等疾病[1-3]。中藥黃精的化學成分較為復雜，主要化學成分有皂苷、黃酮類、多糖、氨基酸等。皂苷成分中，主要以人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷為主，也有文獻報道測定黃精中的菝葜皂苷元，皂苷類化合物具有抗菌抗炎、抗腫瘤、防治心血管疾病等藥理作用[4-10]。近些年，黃精中的皂苷類成分一直是黃精藥物研究的關鍵。經(jīng)研究證明，東北黃精因種植環(huán)境的不同，與其他地區(qū)黃精相比，其化學成分及含量有所不同[11-13]。東北黃精亦是一種藥食兩用的中藥資源，具有極高的藥用價值和保健作用[14]。

本研究中，東北黃精大鼠灌胃后采取96孔板血漿處理技術[15-16]，應用液質(zhì)聯(lián)用(MRM法)測定大鼠血漿中薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1和菝葜皂苷元的濃度，研究人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元的藥代動力學，為黃精的中醫(yī)臨床應用提供理論數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫超高液相色譜儀(Agilent 1200)；安捷倫三重四級桿質(zhì)譜儀(Aglient 6410)；96孔板處理器(美國瓦里安公司)；BT-25 電子分析天平(德國 Sartourious公司)；Milli-Q Gradient A10超純水器(美國Millipore公司)；人參皂苷Rb1對照品(中國食品藥品鑒定研究院，20200906);薯蕷皂苷對照品(中國食品藥品鑒定研究院，20200603)；菝葜皂苷元對照品(中國食品藥品鑒定研究院，20200618)；甘草次酸對照品(中國食品藥品鑒定研究院，20200523)；東北黃精生藥材(黑龍江省天問山農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學孫慧峰教授鑒定為百合科植物黃精)；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國默克公司)；正丁醇、乙酸乙酯(分析純，天津富宇精細化工有限公司)。

1.2 實驗動物

SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供；飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃，濕度為(50±2)%，采用12 h交替光照，適應性飼養(yǎng)兩周，實驗前禁食不禁水12 h。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液

精密稱取人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元對照品各10 mg，分別置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解后稀釋至刻度，混勻，制成濃度為1 mg/mL的對照品溶液(儲備液)。精密稱取人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元儲備液適量，配置成濃度為20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的標準溶液。用大鼠空白血漿進行稀釋，得到濃度分別為1、2.5、5、10、25、50、100、250 ng/mL濃度的血漿標準工作液。

1.3.2 內(nèi)標溶液

精密稱取10 mg甘草次酸對照品，放于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解、稀釋至刻度后混勻，制得1 mg/mL的甘草次酸儲備液。稱取甘草次酸儲備液適量，制得200 ng/mL的甘草次酸內(nèi)標溶液。

1.3.3 黃精提取液

稱取黃精干燥根莖，粉碎后過4號篩，以15倍量的75%乙醇加熱回流提取兩次(1.5 h/次)，合并兩次濾液，采用0.25 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液用0.9%氯化鈉溶液稀釋10倍，備用。

1.3.4 質(zhì)控溶液

精密稱取人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元儲備液適量，用空白血漿進行稀釋，制備濃度為5、50、200 ng/mL的人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元樣品溶液。

1.4 色譜、質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜

色譜柱：安捷倫 SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相：A甲醇-B 0.1%甲酸溶液(70∶30)等度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜

使用電噴霧離子源，掃描方式為多級反應檢測(MRM)，在正離子模式下進行數(shù)據(jù)采集。正離子模式下質(zhì)譜條件：毛細管電壓：3.5 KV；干燥器：N2；干燥器溫度：350℃；去溶劑流量：10 L/min；檢測離子對：人參皂苷Rb1(m/z 1131.6→365.7)，薯蕷皂苷(m/z 890.5→721.3)，菝葜皂苷元(m/z 439.7→417.6)，內(nèi)標甘草次酸(m/z 491.5→425.3)；碰撞電壓：人參皂苷Rb1為65 eV，薯蕷皂苷為50 eV，菝葜皂苷元為40 eV，內(nèi)標甘草次酸為50 eV。

1.5 生物樣品的制備

取100 μL血漿標準工作溶液、空白血漿及質(zhì)控樣品，分別加入96孔板，除空白血漿外分別加入5 μL的內(nèi)標工作溶液，渦旋5 min后，加入10 μL NaOH溶液(0.1 mol/L)，繼續(xù)渦旋1 min?；靹蚝蠹尤?.5 mL正丁醇，反復振搖、混合均勻后，2 000 r/min離心10 min，-20 ℃冷凍2 h，取0.4 mL上層溶液，以氮氣吹干，取100 μL流動相復溶。

1.6 動物分組及給藥

SD大鼠6只，雌雄各半，作為實驗組，禁食不禁水12 h，灌胃東北黃精提取液。空白組灌胃給予蒸餾水，給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 h，通過眼眶取0.5 mL血后放于肝素鈉離心管，離心后制備血漿，藥動學參數(shù)采用Winnorlin軟件進行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

優(yōu)化液相色譜條件時，結(jié)合保留時間、分離度、拖尾因子等因素，對流動相和洗脫梯度進行考察。綜合考慮，選擇甲酸水和甲醇作為流動相，梯度為70∶30。在數(shù)據(jù)采集模式考察中，通過比較人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元和內(nèi)標甘草次酸在正離子掃描模式和負離子掃描模式下的響應值，結(jié)果正離子響應值較高，所以本研究選擇正離子模式采集數(shù)據(jù)。經(jīng)優(yōu)化，人參皂苷Rb1最佳碰撞電壓為65 eV，薯蕷皂苷為50 eV，菝葜皂苷元為40 eV，甘草次酸為50 eV。通過一級質(zhì)譜全掃描，薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1、菝葜皂苷元和甘草次酸的[M+Na]+分別為m/z 890.5、1131.5、439.7和491.5。經(jīng)二級質(zhì)譜全掃描可發(fā)現(xiàn)并確定人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元和內(nèi)標甘草次酸的定量離子反應對分別為m/z 1 131.6→365.7、m/z 890.5→721.3、m/z 439.7→417.6、m/z 491.5→425.3。人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元和內(nèi)標甘草次酸的一、二級質(zhì)譜圖結(jié)果見圖1。

注：A.人參皂苷Rb1一級;B.人參皂苷Rb1二級;C.薯蕷皂苷一級;D.薯蕷皂苷二級;E.菝葜皂苷元一級;F.菝葜皂苷元二級;G.內(nèi)標一級；H.內(nèi)標二級。圖1 一級、二級質(zhì)譜圖

2.2 專屬性

考察血漿樣品所需萃取溶劑時，發(fā)現(xiàn)正丁醇的提取效率最高，血漿生物樣品所受的基質(zhì)干擾效應最少，故選擇正丁醇作為本次生物樣品的提取溶劑。將血漿樣品按“1.5”項下方式進行處理，經(jīng)LC-MS/MS法檢測后，色譜圖結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1、菝葜皂苷元和甘草次酸的保留時間分別為3.3 min、3.5 min、4.0 min及2.8 min，無內(nèi)源性成分干擾目標化合物的檢測。

注：A.空白血漿(m/z 1131.6→365.7);B.樣品血漿(m/z 1131.6→365.7)；C.空白血漿(m/z 890.5 →721.3);D.樣品血漿(m/z 890.5→721.3)E.空白血漿(m/z 439.7→417.6);F.樣品血漿(m/z 439.7→417.6);G.空白血漿(m/z 491.5→425.3);H.樣品血漿(m/z 491.5→425.3)。圖2 大鼠血漿樣品MRM掃描色譜圖

2.3 線性方程、線性范圍和定量限

按“1.5”項下生物樣品的制備方法，分別取100 μL空白血漿，精密加入不同量的人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元和內(nèi)標工作溶液5 μL，得對照品溶液(薯蕷皂苷濃度分別為20、40、80、120、160、220 ng/mL，人參皂苷Rb1濃度為5、10、20、40、100、200 ng/mL，菝葜皂苷元為10、20、40、60、100、150 ng/mL)。每種濃度平行5份樣品，取以上對照品混合溶液10 μL進樣，以各皂苷化合物與甘草次酸峰面積比為縱坐標，以濃度為橫坐標，按“1.4”項下方法測定，利用加權(1/x)最小二乘法分別得出薯蕷皂苷、人參皂苷Rb1及菝葜皂苷元的回歸方程(表1)。3種皂苷線性范圍分別為5～200 ng/mL、20～220 ng/mL、10～150 ng/mL，且線性關系良好。

表1 3種皂苷的線性考察(n=5)

2.4 準確度和精密度

測定“1.3.4”項下制備的質(zhì)控溶液，通過測定皂苷類化合物低、中、高濃度質(zhì)控樣品計算血漿樣品中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元的準確度和精密度，結(jié)果見表2。

表2 精密度和準確度考察(n=5)

2.5 提取回收率和基質(zhì)效應

提取回收率是綜合評價生物樣品分析方法的重要指標，其反應生物樣品中目標化合物的提取效率[17]。考察基質(zhì)效應有柱后灌流和標準添加兩種方法[18-21]。本研究采用標準添加法考察樣品的基質(zhì)效應。

按“1.3.4”測定5、50、200 ng/mL 3個濃度的大鼠血漿質(zhì)控樣品，經(jīng)測定得峰面積為A1；需要加入對應濃度純標準品溶液，經(jīng)測定峰面積為A2；空白血漿樣品加入對應濃度純標準品后，經(jīng)測定峰面積為A3；計算回收率和基質(zhì)效應，回收率為A1與A3的比值，基質(zhì)效應為A3與A2的比值，見表3。該分析方法提取回收率良好，基質(zhì)干擾效應小。

表3 血漿中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元回收率與基質(zhì)效應值

2.6 穩(wěn)定性

考察5、50、200 ng/mL 3個濃度的質(zhì)控生物樣品分別在25 ℃環(huán)境下放置4 h、冷凍放置(-20 ℃)30 d、凍融循環(huán)(3次)后的穩(wěn)定性，見表4。血漿樣品中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷及菝葜皂苷元在各放置條件下均有較好穩(wěn)定性。

表4 大鼠血漿中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷、菝葜皂苷元穩(wěn)定性

2.7 大鼠灌胃黃精提取液后3種皂苷化合物的藥代動力學研究

利用所建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，對東北黃精提取液灌胃后大鼠血漿樣品中皂苷類成分進行濃度測定。以給藥時間作為橫坐標，血藥濃度為縱坐標，繪制3種皂苷類成分的藥時曲線。應用Winnorlin軟件以非房室模型進行統(tǒng)計學處理，并計算藥代動力學參數(shù)，結(jié)果見圖3。

圖3 給藥后血漿中人參皂苷Rb1、薯蕷皂苷和菝葜皂苷元的血藥濃度-時間曲線

結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)血藥濃度的達峰時間tmax為(2.03±0.32)h，半衰期t1/2為(8.57±0.53)h，最大血藥濃度Cmax為(90.37±21.08)ng/mL，AUC0～24為(1 095.83±87.36)(ng·h)/mL；薯蕷皂苷的達峰時間tmax為(1.91±0.54)h，半衰期t1/2為(7.34±0.68)h，最大血藥濃度Cmax為(55.21±20.12)ng/mL，AUC0～24為(735.65±64.36)(ng·h)/mL；菝葜皂苷元在大鼠體內(nèi)血藥濃度的達峰時間tmax為(1.16±0.19)h，半衰期t1/2為(6.85±0.52)h，最大血藥濃度Cmax為(136.27±39.05)ng/mL，AUC0～24為(1648.96±103.26)(ng·h)/mL。

3 結(jié)論

目前，對黃精的研究多集中在皂苷、黃酮及多糖成分的分離、鑒定和藥理作用相關機制，但對黃精主成分的體內(nèi)過程及藥代動力學研究較少。本研究首次利用LC-MS/MS法對大鼠灌胃給予黃精提取物后血漿中3種皂苷類成分的血藥濃度進行了測定。本研究應用96孔板系統(tǒng)制備大鼠血漿生物樣品，高效進行多個樣品的處理；采用專屬性強、靈敏度高的MRM掃描方式，縮短了樣品分析時間。同時，經(jīng)過測定條件優(yōu)化和方法學驗證，最終利用該方法對3種皂苷成分的藥代動力學進行了研究，為黃精體內(nèi)有效成分的確定提供了基礎數(shù)據(jù)，也為東北黃精的質(zhì)量控制和資源開發(fā)提供參考。