王姝妍 李建宏

摘要 描述了模擬微生物連續(xù)培養(yǎng)的裝置。通過(guò)止水夾調(diào)控不同回路，使該裝置可以模擬有氧、無(wú)氧發(fā)酵以及連續(xù)培養(yǎng)3種培養(yǎng)方式，并可同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中CO2的產(chǎn)生和發(fā)酵產(chǎn)物的變化，探尋酵母的不同代謝過(guò)程。通過(guò)該裝置實(shí)驗(yàn)運(yùn)行結(jié)果的分析，可進(jìn)一步加深對(duì)酵母呼吸代謝相關(guān)知識(shí)點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，以及酵母培養(yǎng)在生產(chǎn)實(shí)踐中運(yùn)用的理解。該裝置材料易得，操作簡(jiǎn)捷，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，適用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

關(guān)鍵詞 酵母 連續(xù)培養(yǎng)裝置 呼吸作用 酒精發(fā)酵 CO2

中圖分類(lèi)號(hào) G633.91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

“探究酵母細(xì)胞的呼吸方式”實(shí)驗(yàn)是高中生物學(xué)《必修1·分子與細(xì)胞》的內(nèi)容。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)，學(xué)生了解了酵母細(xì)胞的兼性厭氧特性：在有氧氣存在的情況下進(jìn)行需氧呼吸，迅速產(chǎn)生二氧化碳;在氧氣缺乏的情況下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，緩慢產(chǎn)生CO2并產(chǎn)生乙醇。在2004年版高中生物學(xué)教材中，另一個(gè)與酵母相關(guān)的實(shí)驗(yàn)是《選修1·生物技術(shù)實(shí)踐》中的“酵母細(xì)胞的固定化”。這一實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容旨在讓學(xué)生了解固定化細(xì)胞技術(shù)與其生產(chǎn)應(yīng)用。針對(duì)上述涉及酵母細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，筆者設(shè)計(jì)了一款多功能的實(shí)驗(yàn)裝置。該簡(jiǎn)易裝置可實(shí)現(xiàn)以下功能：作為酵母細(xì)胞厭氧發(fā)酵裝置、作為酵母細(xì)胞有氧呼吸裝置、以及作為酒精工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)裝置?！镀胀ǜ咧猩飳W(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》提出以學(xué)科大概念為核心，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)探究能力和社會(huì)責(zé)任感。該裝置在教學(xué)中的使用可以促進(jìn)學(xué)生實(shí)現(xiàn)相關(guān)知識(shí)點(diǎn)的融會(huì)貫通，并進(jìn)一步了解酵母細(xì)胞培養(yǎng)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。下面就該裝置的設(shè)計(jì)和搭建以及其在教學(xué)中的應(yīng)用展開(kāi)討論。

1裝置設(shè)計(jì)

1.1器材和試劑

器材：錐形瓶、燒杯、燒瓶、硬紙箱/泡沫箱、玻璃導(dǎo)管、橡膠塞、橡皮管、止水夾、希爾球、磁力攪拌器。

試劑：干酵母粉、海藻酸鈉、無(wú)水CaCl2、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液、澄清石灰水、石蠟。

1.2設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。通過(guò)止水夾對(duì)裝置進(jìn)行調(diào)

整，可以實(shí)現(xiàn)3個(gè)不同的功能（表1）：1酵母細(xì)胞厭氧發(fā)酵裝置：關(guān)閉磁力攪拌器，夾緊止水夾a和止水夾c，打開(kāi)止水夾b，就能營(yíng)造一個(gè)無(wú)氧的密閉發(fā)酵環(huán)境。2酵母細(xì)胞有氧呼吸裝置：關(guān)閉磁力攪拌器，夾緊止水夾a，打開(kāi)止水夾b和止水夾c，在錐形瓶D的橡膠塞上插入臨時(shí)玻璃導(dǎo)管，利用洗耳球不斷向?qū)Ч艽等肟諝?，就能營(yíng)造一個(gè)有氧呼吸環(huán)境。此時(shí)錐形瓶D中的溶液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液，除去吹入空氣中的CO2，保證了實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性。3酒精工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)裝置：酒精工業(yè)生產(chǎn)中，往往采用連續(xù)培養(yǎng)的體系，且與固定化酵母細(xì)胞配合。夾緊止水夾b，打開(kāi)止水夾a和止水夾c，打開(kāi)磁力攪拌器。利用虹吸原理可使錐形瓶D中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖溶液不斷流入錐形瓶B中，而發(fā)酵產(chǎn)品則同時(shí)流入容器A中。這樣就能模擬酒精工業(yè)生產(chǎn)中的連續(xù)培養(yǎng)體系。酵母細(xì)胞在錐形瓶B中厭氧發(fā)酵產(chǎn)生酒精，產(chǎn)物收集在容器A中。

2裝置搭建

首先準(zhǔn)備2個(gè)500mL錐形瓶，2個(gè)500mL燒杯（或1個(gè)500mL燒杯，1個(gè)500mL燒瓶），清洗干凈。將制備好的酵母細(xì)胞凝膠珠用清水沖洗2或3次。接著，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要向錐形瓶中倒入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的葡萄糖溶液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液約300mL，向裝有葡萄糖溶液的錐形瓶中倒入約30粒凝膠珠并放入磁子。用橡膠塞密封兩個(gè)錐形瓶瓶口。向一個(gè)燒杯中倒入澄清石灰水約150mL。隨后，利用玻璃導(dǎo)管和橡皮管將裝置聯(lián)通，并將止水夾夾在特定的位置。最后采用硬紙箱或泡沫箱調(diào)整裝置高度。

3裝置運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

3.1材料準(zhǔn)備

1制備酵母細(xì)胞凝膠珠：稱(chēng)取0.83g無(wú)水CaCl2粉末，溶于150mL水中，得到物質(zhì)量濃度為0.05mol/L的CaCl2溶液。稱(chēng)取0.7g海藻酸鈉，溶于10mL水中，在60°C的水浴加熱條件下攪拌至成為糊狀，用蒸餾水定容至10mL，冷卻至室溫，得到海藻酸鈉懸液。將海藻酸鈉懸液和酵母細(xì)胞懸液均勻混合后吸入注射器，以恒定速度滴入CaCl2溶液中，得到酵母細(xì)胞凝膠珠。

2制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為10%的葡萄糖溶液和NaOH溶液。

3制備澄清石灰水：用藥匙取少量的生石灰固體于燒杯中，加水后攪拌使之溶解。過(guò)濾即得到澄清石灰水。

4制備酸性重鉻酸鉀溶液用于發(fā)酵產(chǎn)物酒精的檢測(cè)。

3.2探究酵母細(xì)胞的呼吸方式

1當(dāng)探究酵母細(xì)胞的有氧呼吸時(shí)，關(guān)閉磁力攪拌器，夾緊止水夾a，打開(kāi)止水夾b和止水夾c，在錐形瓶D橡膠塞上插入臨時(shí)玻璃導(dǎo)管。此時(shí)，錐形瓶D中液體為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液。利用洗耳球向臨時(shí)導(dǎo)管中吹入空氣。酵母細(xì)胞在錐形瓶B中進(jìn)行有氧呼吸，迅速產(chǎn)生CO2，使燒杯C中的澄清石灰水變渾濁。

2當(dāng)探究酵母細(xì)胞厭氧發(fā)酵時(shí)，關(guān)閉磁力攪拌器，夾緊止水夾a和止水夾c，打開(kāi)止水夾b，酵母細(xì)胞在錐形瓶B中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生乙醇，并緩慢產(chǎn)生CO2，使得燒杯C中的澄清石灰水輕微變渾濁。為了達(dá)到更好的密封效果，可在錐形瓶B溶液液面鋪一層石蠟。

3.3酒精工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)裝置

夾緊止水夾b，打開(kāi)止水夾a和止水夾c，打開(kāi)磁力攪拌器。此時(shí)錐形瓶D中為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%葡萄糖溶液。利用洗耳球在容器A導(dǎo)管中抽氣，直到錐形瓶D中的溶液不斷流入錐形瓶B的錐形瓶中，而發(fā)酵產(chǎn)品則同時(shí)流入容器A中。打開(kāi)止水夾b，可觀察到澄清石灰水變渾濁。為了達(dá)到更好的密封效果，可在錐形瓶B溶液液面鋪一層石蠟。

4總結(jié)討論

固定化細(xì)胞是中學(xué)中熟知的實(shí)驗(yàn)，但大部分人對(duì)于固定化酵母細(xì)胞的實(shí)際運(yùn)用卻所知甚少。在發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過(guò)程中，由于酵母對(duì)于細(xì)胞是有毒害作用的物質(zhì)，伴隨發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)展，發(fā)酵液中乙醇濃度不斷升高，就會(huì)毒害酵母，限制發(fā)酵過(guò)程。只有從發(fā)酵液中不斷移除已產(chǎn)生的乙醇，才能進(jìn)一步發(fā)酵。用固定化細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，既可以使含高濃度乙醇的發(fā)酵液持續(xù)流出，新鮮的發(fā)酵液流入發(fā)酵容器，同時(shí)酵母細(xì)胞又可完全保留在發(fā)酵容器中，維持高細(xì)胞濃度，獲得較高的產(chǎn)率。本實(shí)驗(yàn)就是基于這一生產(chǎn)原理，設(shè)計(jì)搭建了這一實(shí)驗(yàn)裝置。

該多功能裝置既可運(yùn)用于新知識(shí)教學(xué)，又可運(yùn)用于復(fù)習(xí)課中。在開(kāi)展教學(xué)前，教師可根據(jù)需要錄制裝置的組裝視頻以輔助教學(xué)。以往學(xué)生在學(xué)習(xí)“探究酵母細(xì)胞呼吸方式”與“固定化酵母細(xì)胞”的知識(shí)點(diǎn)時(shí)，常常難以將其與實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)進(jìn)行聯(lián)系。利用本裝置中的“酒精工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)裝置”，教師可以引導(dǎo)學(xué)生深入探索酒精的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程。首先，酒精工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程既涉及到酵母細(xì)胞的有氧呼吸，用于酵母細(xì)胞的大量增殖，亦涉及到厭氧發(fā)酵，用于酒精的轉(zhuǎn)化。在對(duì)比單個(gè)酵母細(xì)胞兩種呼吸方式時(shí)，教材中使用“產(chǎn)生大量CO2”和“產(chǎn)生少量CO2”分別形容有氧呼吸和厭氧發(fā)酵。然而，根據(jù)巴斯德效應(yīng)，酵母細(xì)胞的糖發(fā)酵會(huì)為氧氣所抑制。因此，結(jié)合生產(chǎn)，教師可啟發(fā)學(xué)生思考：“酵母有氧呼吸產(chǎn)生的CO2是否一定多于厭氧發(fā)酵？”。其次，固定化細(xì)胞與連續(xù)培養(yǎng)體系的結(jié)合在酒精的工業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的意義。在連續(xù)培養(yǎng)中，游離酵母細(xì)胞因產(chǎn)物流出而導(dǎo)致密度下降，而固定化酵母細(xì)胞在發(fā)酵中能維持較大細(xì)胞密度;固定化酵母細(xì)胞相比于游離酵母細(xì)胞對(duì)酒精產(chǎn)物脅迫的耐受性更強(qiáng)。最后，酒精除了與食品工業(yè)相關(guān)，還是重要的化工原料和代用燃料。教師可借此背景進(jìn)一步引領(lǐng)學(xué)生體會(huì)微生物與人類(lèi)生活的聯(lián)系，生物技術(shù)與人類(lèi)生產(chǎn)的聯(lián)系。

參考文獻(xiàn)：

[1]張雪萍“.酵母細(xì)胞的固定化”實(shí)驗(yàn)探究[J].中學(xué)生物教學(xué)，2019，（16）：38-39.

[2]劉恩山.普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）解讀[M].高等教育出版社，2018.

[3]Pieter J.Verbelen，David P.Schutter，F(xiàn)ilip Delvaux，et al.Immobilized yeast cell systems for continuous fermentation appli?cations[J].Delvaux.Biotechnology Letters，2006，28（19）：1515-1525.

[4]Moreno-García Jaime，García-Martínez Teresa，Mauricio JuanC，et al.Yeast Immobilization Systems for Alcoholic Wine Fer?mentations：Actual Trends and Future Perspectives[.J].Frontiers in microbiology，2018，（9）：241.

[5]孫東方，宋寶江，郭時(shí)杰.我國(guó)酒精工業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策[J].釀酒，2004，（5）：9-10.