謝宏妮 李雪峰

摘要 主要從胰蛋白酶和膠原蛋白酶的作用特點(diǎn)、使用方法等方面考慮，闡明細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一般只選用胰蛋白酶的原因，為一線(xiàn)教師教學(xué)提供參考。

關(guān)鍵詞 胰蛋白酶 膠原蛋白酶 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào) Q-49

文獻(xiàn)標(biāo)志碼 E

2021年廣東省普通高中學(xué)業(yè)水平選擇考適應(yīng)性測(cè)試（生物學(xué)）中第22題（選修3：現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題）的第4小題的第二個(gè)填空，有關(guān)貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)常用什么酶進(jìn)行消化處理一問(wèn)，超過(guò)30%的學(xué)生填寫(xiě)了“膠原蛋白酶”，與答案不符。

事實(shí)上，在人教版高中生物學(xué)新舊兩版教材《選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》《選修3·現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題》中，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)用“胰蛋白酶”還是“膠原蛋白酶”這一問(wèn)題均有直接闡述，但沒(méi)有說(shuō)明二者區(qū)別并辨析相關(guān)原因。例如，在《選擇性必修3·生物技術(shù)與工程》中，表述為“在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，首先要對(duì)新鮮取材的動(dòng)物組織等進(jìn)行處理，或用機(jī)械的方法，或用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時(shí)間，將組織分散成單個(gè)細(xì)胞”“在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，貼壁細(xì)胞需要重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個(gè)的細(xì)胞”。從學(xué)生對(duì)相關(guān)問(wèn)題的作答情況來(lái)看，他們明顯混淆了“胰蛋白酶”和“膠原蛋白酶”的作用特點(diǎn)及情況。這可能是教師與學(xué)生對(duì)教材相關(guān)描述的誤解所導(dǎo)致。

盡管胰蛋白酶和膠原蛋白酶都是細(xì)胞培養(yǎng)中常用于將體積較小的組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞的消化液，但它們的作用機(jī)制及適用情況并不相同。下面旨在通過(guò)胰蛋白酶和膠原蛋白酶的作用特點(diǎn)、使用方法等，闡明兩種酶的區(qū)別與細(xì)胞培養(yǎng)中的使用情況。

1胰蛋白酶和膠原蛋白酶的作用特點(diǎn)

1.1胰蛋白酶的作用特點(diǎn)

胰蛋白酶分離自牛、豬等動(dòng)物的胰，作用于與賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鏈，除去細(xì)胞間黏蛋白及糖蛋白，從而使細(xì)胞分離，是應(yīng)用廣泛的消化物，適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮組織、肝、腎等軟組織以及傳代細(xì)胞等。胰蛋白酶的消化作用與酶的濃度、pH、溫度、組織塊的大小以及組織的硬度都有關(guān)系。胰蛋白酶濃度過(guò)大或消化時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被消化;但反之消化不充分也達(dá)不到分散細(xì)胞的目的。此外，血清明顯抑制胰蛋白酶的活性，Ca2+和Mg2+對(duì)胰蛋白酶的活性有一定抑制作用。

1.2膠原蛋白酶的作用特點(diǎn)

膠原蛋白酶是能在一定的pH和溫度下切割膠原蛋白主體螺旋多肽鏈的酶類(lèi)，主要用于水解結(jié)締組織中的膠原蛋白，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。當(dāng)擬消化的組織較硬，內(nèi)含較多的結(jié)締組織或膠原成分時(shí)，用胰蛋白酶解離細(xì)胞效果較差，可采用膠原酶解離細(xì)胞法。鈣、鎂離子以及血清不會(huì)影響膠原酶的消化作用，其消化作用緩和，且無(wú)需機(jī)械振蕩（表1）。

與胰蛋白酶不同的是許多動(dòng)物的組織細(xì)胞和微生物都是它的來(lái)源，其中細(xì)菌是微生物膠原蛋白的主要來(lái)源，已發(fā)現(xiàn)40多種。目前商業(yè)化提供的細(xì)菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異，分為4種類(lèi)型：

（1）膠原酶I型：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性），通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備。

（2）膠原酶II型：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來(lái)源細(xì)胞的制備。

（3）膠原酶III型：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細(xì)胞的制備。

（4）膠原酶IV型：含有低胰酶活性，通常用于胰島細(xì)胞的制備，或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。

2兩種蛋白酶在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

2.1原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)是從供體獲取組織或細(xì)胞進(jìn)行的首次

培養(yǎng)，也叫初代培養(yǎng)。由于取得的組織和細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，具有二倍體遺傳性狀，在供體來(lái)源充分、條件穩(wěn)定的情況下（年齡、性別），能在一定程度上反映體內(nèi)狀態(tài)。原代培養(yǎng)的組織通常由多種細(xì)胞成分組成，較為復(fù)雜，即使培養(yǎng)較純的單一類(lèi)型的細(xì)胞，如上皮或成纖維細(xì)胞，也仍然存在著異質(zhì)性。正因如此，胰蛋白酶和膠原酶均可在原代細(xì)胞培養(yǎng)中的酶消化培養(yǎng)法中使用，以便將組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，從而達(dá)到細(xì)胞快速長(zhǎng)成單層的目的。本法尤適用于培養(yǎng)大量組織，細(xì)胞產(chǎn)量高。

2.2傳代培養(yǎng)

當(dāng)原代培養(yǎng)成功，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖形成單層細(xì)胞后，會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)展匯合，占滿(mǎn)一切空間。此時(shí)，就需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，這一操作即稱(chēng)為傳代或再培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)一般選擇細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期進(jìn)行。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)而言，通常采用酶消化法，且一般選用胰蛋白酶。這是因?yàn)閭鞔囵B(yǎng)的過(guò)程其實(shí)就是細(xì)胞的分離稀釋?zhuān)藭r(shí)細(xì)胞間質(zhì)較少，且不含較多的結(jié)締組織或膠原成分。