韓飛飛，劉亞群，廖晶，田美嬌，王一林，李宗澤

(錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121000)

2010年，全世界估計有2.85億人患有糖尿病，預(yù)計到2030年，這一數(shù)字將增加到4.39億[1]。糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)是糖尿病的主要并發(fā)癥，其主要特征是神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)和化學(xué)物質(zhì)組成的異常，并伴有認(rèn)知功能障礙[2]。DE給患者的家庭帶來了巨大的痛苦，令患者的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，然而遺憾的是，時至今日，DE發(fā)病的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。

高血糖狀態(tài)下引起的機(jī)體氧化損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是糖尿病腦病發(fā)生的重要原因之一，Nan F的研究指出，甲基乙二醛是高血糖癥的高反應(yīng)性代謝產(chǎn)物，也是糖基化終產(chǎn)物的主要前體，可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡[3]。Dolors Puigoriol在高脂膳食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型體內(nèi)，氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS) 和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平明顯升高[4]。雖然大量臨床研究指出，氧化應(yīng)激、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、DE間存在著相關(guān)性，但具體涉及到的信號通路仍不甚明了。

HiPPO信號通路最早在果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，屬于一種抑制性信號通路。機(jī)體可以通過該信號通路的核心成分對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。Fan Yu的研究指出，在糖尿病腦病小鼠模型體內(nèi)，存在Hippo信號通路的異常，改善Hippo信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，可能有助于DE的治療[6]。轉(zhuǎn)錄輔激活因子Yes-相關(guān)蛋白(yes-associated protein，YAP)是Hippo通路的下游效應(yīng)分子，Bcl-2蛋白是Hippo信號通路的調(diào)節(jié)因子之一。Gun Woo Won的研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl-2可以通過與Hippo信號通路中的關(guān)鍵蛋白哺乳動物ste20-like激酶(mammalian ste20-like kinases，MST1/2)和支架蛋白Salvador-1(SAV1)的直接作用來調(diào)節(jié)Hippo信號通路所致的細(xì)胞凋亡[7]。

梓醇是我國傳統(tǒng)中藥地黃的主要成分，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，Liu S的研究認(rèn)為，梓醇能夠有效改善鏈脲佐霉素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，是一種很好的神經(jīng)保護(hù)劑[8]。I-Cheng Chen 的實驗發(fā)現(xiàn)，梓醇在脊髓小腦的共濟(jì)失調(diào)模型中具有很強(qiáng)的抗氧化損傷作用[9]。我們之前的研究也驗證了梓醇可以明顯改善高糖導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡，但是詳細(xì)機(jī)制并未探討[10]。

本研究擬采用高糖誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡模擬糖尿病腦病狀態(tài)下的神經(jīng)元凋亡模型，選用梓醇作為保護(hù)藥物，探討其抗凋亡作用機(jī)制是否與Bcl-2蛋白和YAP蛋白有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

梓醇購自購自中國藥品生物制品檢定所(純度≥98%)；CCK-8試劑盒(美國Glpbio公司)；D-無水葡萄糖、胰蛋白酶-EDT消化液、胎牛血清、AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Themro Fisher公司)。兔抗人YAP1多克隆抗體、小鼠抗人Actin單克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體、山羊抗鼠IgG抗體(美國Themro Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。SH-SY5Y細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，添加青霉素100 Ku/L和鏈霉素100 mg/L，置于恒溫37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為正常對照組：用低糖DMEM培養(yǎng)48 h；高糖組：用含葡萄糖80 mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h；梓醇保護(hù)組：用含葡萄糖80 mmol/L+梓醇0.5、1、2 mg/mL的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至105個/mL接種在96孔板中，每孔100 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后，按照1.2.1的處理方法培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入10 μL CCK8溶液，放入培養(yǎng)箱中孵育2 h。酶標(biāo)儀450 nm處測量吸光度值(A值)[11]。

1.2.3 DCFH-DA探針法檢測活性氧含量

按照 1∶1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋 DCFH-DA，使終濃度為 10 μmol/L。收集按照1.2.1的處理方法培養(yǎng)的各組細(xì)胞后，懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至107個/毫升，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育20 min。每隔3 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。使用 488 nm 激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長的熒光酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度[12]。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

按照1.2.1的處理方法培養(yǎng)處理各組細(xì)胞結(jié)束后，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，離心后沉淀細(xì)胞。用結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為2×106個/毫升，取100 μL的細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V/Alexa Fluor 488混勻后于室溫避光孵育5 min，加入10 μL 20 μg/mL 的碘化丙錠溶液(PI)，并加400 μL PBS溶液，立刻進(jìn)行流式檢測[13]。

1.2.5 Western blot法檢測蛋白質(zhì)的含量

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照2×105個/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，根據(jù)1.2.1的處理方法培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng) 10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離，冰浴轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用YAP的一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜，PBST洗3次，每次10 min，分別加入對應(yīng)的二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min。內(nèi)參選用Actin。采用化學(xué)發(fā)光法顯影，通過凝膠成像儀采集圖片，蛋白表達(dá)水平采用AlphaView SA軟件分析蛋白表達(dá)情況[14]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行描述性分析與方差分析，實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

與正常對照組相比，高糖對細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用(P<0.05)。不同濃度的梓醇對高糖的抑制增殖作用有明顯的改善(P<0.05)，見表1。

表1 梓醇對高糖作用SH-SY5Y細(xì)胞增值率的影響

2.2 DCFH-DA探針法檢測活性氧含量

與正常對照組相比，高糖組ROS含量明顯升高(P<0.05)。不同濃度的梓醇保護(hù)組細(xì)內(nèi)ROS含量明顯減少(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表2。

表2 梓醇對高糖作用SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

與正常對照組相比，高糖組細(xì)胞的早期凋亡率明顯升高(P<0.05)。與高糖組相比，梓醇保護(hù)組細(xì)胞的早期凋亡率明顯降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見表3，圖1。

表3 梓醇對高糖作用SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響

A:正常對照組；B:高糖組；C:梓醇0.5 mg/mL組；D:梓醇1 mg/mL組；E:梓醇2 mg/mL組

2.4 Western blot法檢測YAP、Bcl-2蛋白質(zhì)的含量

與正常對照組相比，高糖組YAP蛋白，Bcl-2蛋白含量明顯下降(P<0.05)，與高糖組相比，梓醇保護(hù)組細(xì)胞YAP蛋白，Bcl-2蛋白含量明顯升高(P<0.05)，結(jié)果見表4、圖2。

表4 Western blot法檢測YAP、Bcl-2蛋白質(zhì)的含量

3 討 論

糖尿病并發(fā)癥(糖尿病腎病、足潰瘍、視網(wǎng)膜病變等)和合并癥(糖尿病合并腫瘤、糖尿病合并脂肪肝等)是糖尿病患者致殘、致死的首要原因。高血糖引發(fā)并發(fā)癥/合并癥的原因眾多，如多元醇通路、蛋白激酶C、糖基化終末產(chǎn)物、炎癥等，但究其上游均與氧化應(yīng)激/活性氧自由基(ROS)的過度生成有關(guān)。Huang等人的研究指出，在糖尿病大鼠模型體內(nèi)，存在丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的異常升高[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平達(dá)到了(292.16±9.21)%，而細(xì)胞凋亡率則為(40.77±1.98)%，與正常組相比均明顯升高(P<0.05)，提示高糖狀態(tài)下的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡很可能與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。梓醇作為傳統(tǒng)中藥地黃的主要有效成分之一具有很強(qiáng)的抗氧化能力，Yang等人的研究發(fā)現(xiàn)，梓醇可以明顯改善H2O2誘導(dǎo)的原代皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，并降低神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的MDA和ROS水平[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，低、中、高濃度梓醇保護(hù)組的ROS水平分別為(213.87±8.03)%、(188.43±8.76)%、(127.91±7.65)%，與高糖組相比均明顯下降(P<0.05)，并呈劑量依賴性，提示梓醇可以有效改善高糖所致的SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷。而低、中、高濃度梓醇保護(hù)組的細(xì)胞存活率分別為(35.3±2.13)%、(24.57±1.16)%、(19.69±3.07)%，與高糖組相比均明顯下降(P<0.05)，并呈劑量依賴性，提示梓醇可以對抗高糖所致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

Hippo信號通路可以被物理、化學(xué)以及病理生理狀態(tài)等多種類型的信號所調(diào)節(jié)，Peng的研究指出，高糖可以通過氨基己糖通路令Hippo通路中的關(guān)鍵效應(yīng)分子發(fā)生糖基化的修飾從而激活其轉(zhuǎn)錄活性[17]。轉(zhuǎn)錄輔激活因子Yes-相關(guān)蛋白和帶有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄輔助激活物是Hippo通路的下游效應(yīng)分子，Bcl-2蛋白是Hippo信號通路的調(diào)節(jié)因子之一。但同時，Gun Woo Won的研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2也可以通過與Hippo信號通路中的MST1/2和SAV1的直接作用來調(diào)節(jié)Hippo信號通路對抗細(xì)胞凋亡。本研究中Western blot的結(jié)果顯示，在梓醇保護(hù)組中Bcl-2蛋白、YAP蛋白的表達(dá)與高糖組相比均有所提高(P<0.05)，這說明梓醇可能是通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的含量來調(diào)節(jié)Hippo信號通路中的關(guān)鍵蛋白YAP的含量實現(xiàn)減輕高糖所致的SH-SY5Y的細(xì)胞凋亡，但是這種抗凋亡作用的詳細(xì)分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。