李琬騰 劉 杰 李典鵬 呂 喆 萬 云 冷 欣,3* 安樹青,3

（1 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210046；2 安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院，安徽 合肥 230000；3 南京大學(xué)常熟生態(tài)研究院，江蘇 蘇州 215501）

生態(tài)恢復(fù)和生態(tài)重建是中國濕地恢復(fù)的主要策略，人工干預(yù)可促進濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護恢復(fù)(安樹青等, 2019)。沉水植物作為水生態(tài)系統(tǒng)的重要生產(chǎn)者，在修復(fù)水體污染中因具有去除水體中營養(yǎng)物質(zhì)(Kufel et al, 2002; Clarke et al, 2001)、去除沉積物中污染物(Dai et al, 2014)、促進水體氮磷循環(huán)(Li et al, 2008)、加速生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)(朱江等, 2020)等作用而被廣泛使用。輪葉黑藻(Hydrilla verticillate)屬水鱉科黑藻屬，為多年生沉水植物，普遍生長于世界各處水域中，具有極強的耐污性(林連升等, 2005; Srivastava et al, 2016)，同時自身的凈化能力又使其成為水生植物恢復(fù)過程中的先鋒物種(Wei et al, 2004)。輪葉黑藻通過種子或營養(yǎng)繁殖體進行自我繁殖，且以斷枝進行營養(yǎng)繁殖較為普遍，但該繁殖方式存在占用空間資源大、成苗周期長及種苗價格高等問題(羅錢等, 2021)，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以對輪葉黑藻母本進行快速擴繁(Shasmita et al, 2018；孫敏杰等, 2012)，以解決我國輪葉黑藻野生苗來源不足的關(guān)鍵問題。

目前對輪葉黑藻組培苗的培養(yǎng)液成分、移栽基質(zhì)及種植密度進行了大量的研究，形成了較為成熟的培養(yǎng)及種植體系(蔣金輝, 2007)。煉苗是使植株迅速適應(yīng)環(huán)境，在定植前采取放風(fēng)、降溫、適當(dāng)控水等措施對幼苗強行鍛煉的過程。煉苗技術(shù)對于輪葉黑藻的生長發(fā)育至關(guān)重要，組培苗經(jīng)過室內(nèi)長時間的閉瓶生長，未經(jīng)馴化直接移栽易出現(xiàn)品質(zhì)不佳、倒苗死亡等現(xiàn)象。開蓋煉苗可以短期內(nèi)使組培苗重建自身的獲得性抗逆性(Conrath et al, 2009)，例如張有鐸(2010)和柳躍等(2014)通過此方法提高組培苗移栽存活率。但目前國內(nèi)外關(guān)于輪葉黑藻組培苗在整個生長階段生長生理指標(biāo)變化及煉苗對其環(huán)境適應(yīng)能力的影響研究較少。

通過探究輪葉黑藻組培苗的生長規(guī)律和環(huán)境適應(yīng)能力，以期提高輪葉黑藻組培苗出苗品質(zhì)及其快速適應(yīng)新環(huán)境的能力，為輪葉黑藻組培苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及工程化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

輪葉黑藻在實驗室中繼代培養(yǎng)1年，選取成熟健壯、長勢基本一致的植株，截取片段進行植物組織培養(yǎng)。

1.2 研究方法

1.2.1 植物組織培養(yǎng)試驗按23.7:150:20:1的對應(yīng)比例將MS培養(yǎng)液與蔗糖、BA、IAA等物質(zhì)混合，配置組培苗基礎(chǔ)培養(yǎng)液，pH值為5.6～5.8。將培養(yǎng)液置于高壓滅菌鍋內(nèi)(121℃)滅菌30 min，再置于超凈工作臺中紫外殺菌30 min，待全部滅菌完成即可開始接種。其中組培苗的接種規(guī)格為：長2±0.2 cm、重0.2±0.01 g的成熟健壯輪葉黑藻片段。接種完成并封口后置于25℃恒溫組培室中進行培養(yǎng)，在此期間密切觀察組培苗生長情況以便及時剔除有菌苗。另一組組培架采取遮光處理以避免不同位置產(chǎn)生的光線干擾，固定光源與植物間距離為15 cm，燈與燈之間距離為10 cm。于培養(yǎng)后的第15 d、25 d、35 d、45 d、55 d分別取樣，每次隨機取6瓶，3瓶用于測量干重、鮮重、莖長、分枝數(shù)等生長指標(biāo)，3瓶用于測葉綠素(Chl)等生理指標(biāo)。

1.2.2 開蓋煉苗試驗基于預(yù)實驗以及其他同類型實驗的參考(陳彩霞等, 2004; 柳躍等, 2014)，本實驗通過設(shè)置3種不同開蓋煉苗時間(1 d、3 d、5 d)及3種不同光 周期(6 h/d、9 h/d、12 h/d)進 行3×3正交實驗，每個處理重復(fù)3次。取閉瓶育苗完成且長勢健壯的輪葉黑藻組培苗作為實驗對象，將組培苗置于組培架內(nèi)，對其進行9種不同條件的開蓋煉苗處理，處理完成后將苗置于育苗袋中進行室外馴化培養(yǎng)，馴化用水取自實驗當(dāng)?shù)毓珗@湖水。室外馴化培養(yǎng)14 d后每個條件隨機選取3株組培苗，用于測量可溶性糖、可溶性蛋白及葉綠素等生理指標(biāo)。

1.2.3 樣品指標(biāo)測定方法鮮/干重測定方法為將待測輪葉黑藻樣品所有根、莖、葉均收集起來，洗凈后迅速用濾紙擦干測量鮮重(FW)，在60°C恒溫烘箱中24 h后測定生物量干重(DW)。葉綠素含量測定采用丙酮乙醇混合液法(張憲政, 1986)；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍比色法(王學(xué)奎, 2006)；可溶性總糖含量測定采用蒽酮法(李合生, 2006)。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SPSS軟件進行單因素方差分析、雙因素方差分析、person相關(guān)性分析，采用Origin進行線性回歸擬合，Graphpad prism軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 組培苗生長生理指標(biāo)分析

2.1.1 表型指標(biāo)輪葉黑藻組培苗各表觀形態(tài)指標(biāo)整體呈增長趨勢，并在培養(yǎng)25 d后，各指標(biāo)均隨著組培時間的增加而顯著增加(P＜0.05)，干鮮重以及莖長等指標(biāo)在第45 d分別增加了81.41%、157.72%、8.02%，分 枝 數(shù) 在 第35 d顯 著 增 加66.67%(表1)。組培苗培養(yǎng)初期，因剛接種至瓶內(nèi)新環(huán)境下，組培苗處于初期生長遲緩階段，植物新陳代謝緩慢，故各項生長指標(biāo)未出現(xiàn)顯著上升。而后期隨著組培苗對環(huán)境的不斷適應(yīng)，光合作用不斷增強，逐步進入高速生長階段，這與謝翔(2020)對草莓組培苗的研究結(jié)果相同。此外，輪葉黑藻組培苗各生長指標(biāo)之間出現(xiàn)了異速增長，其中分枝數(shù)最先發(fā)生顯著性變化，表明輪葉黑藻組培苗優(yōu)先實現(xiàn)分支數(shù)的顯著增加而后再加速莖長、干鮮重等生長。

表1 輪葉黑藻組培苗表型指標(biāo)變化Table 1 Changes of apparent type indexes of H. verticillata tissue culture seedlings

2.1.2 生理型指標(biāo)輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb在組培育苗前35 d內(nèi)始終處于下降趨勢，自第25 d起Chla顯著下降49.71%，Chlb顯著下降40.65%(P＜0.05)(表2)?？赡苡捎诮M培苗處于緩苗期，這與陳磊(2019)對白芨苗組培研究的結(jié)果一致；也可能由于組培室內(nèi)光照過強，輪葉黑藻通過減少自身Chla、Chlb含量來減少單位面積Chl酶活性從而避免光氧化(Shigenaga et al, 1994; Salin et al, 1991; Pascal et al, 2005)。緩苗期后輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb含量仍未上升，可能與瓶內(nèi)沒有足夠的氮源供組培苗進行循環(huán)轉(zhuǎn)化有關(guān)(蘇敏, 2020)，而Chlb下降的原因可能是在植物體內(nèi)Chlb往 往 由Chla轉(zhuǎn) 化 形 成(Rüdiger, 2002)。盡管實驗過程中輪葉黑藻組培苗Chla與Chlb始終未呈上升趨勢，但其Chla/b在第45 d有顯著提升，Chla/b是評價植物葉綠素濃度吸光度值的可靠性標(biāo)準，也是反映植物光合作用能力的關(guān)鍵性指標(biāo)(Lee, 2019)，該指標(biāo)的提高說明本實驗中組培苗的光合作用隨時間增加有所增強。

2.1.3 生長指標(biāo)相關(guān)分析為探究輪葉黑藻組培苗生長發(fā)育過程中內(nèi)部生理生態(tài)變化與其表型變化之間的相關(guān)關(guān)系，為生長曲線擬合提供依據(jù)，對輪葉黑藻組培苗干鮮重、莖長等生長指標(biāo)與Chl等生理指標(biāo)進行相關(guān)性分析(表3)。其中輪葉黑藻組培苗各生長指標(biāo)與Chla、Chlb等生理指標(biāo)之間呈顯著負相關(guān)(P＜0.05)，表明植物在生長發(fā)育時期不同生物指標(biāo)之間存在一定差異性(許智宏等, 1998)，由表1、表2可知，輪葉黑藻各項生理性微觀指標(biāo)優(yōu)先于其表型等宏觀指標(biāo)表現(xiàn)出顯著性差異。此外，不同于Chla、Chlb等生理指標(biāo)，輪葉黑藻組培苗的Chla/b指標(biāo)與其生長指標(biāo)之間呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，其中鮮重與Chla/b的相關(guān)系數(shù)最高，達0.747，說明只有較高的Chla/b值，植物才能較好地進行光合作用及生長發(fā)育(金相燦等, 2008)。

表2 輪葉黑藻組培苗生理型指標(biāo)變化Table 2 Changes of physiological type indexes of H. verticillata tissue culture seedlings

2.2 組培苗生長曲線擬合

由于輪葉黑藻組培苗干重含量較低(最小只有0.02 g)，容易因操作誤差而對其數(shù)據(jù)結(jié)果造成較大影響，且組培后期組培苗繁殖較快，分枝數(shù)、芽數(shù)與葉片數(shù)混雜難以分辨及測量，所以本研究以時間為自變量，鮮重為因變量，對組培苗的生長曲線進行擬合，能較大程度減少誤差。由表3的指標(biāo)相關(guān)性分析可知，鮮重與其他表型指標(biāo)之間存在極顯著相關(guān)性(P＜0.01)，以鮮重變化來替代其它類型指標(biāo)的變化也具有一定的科學(xué)依據(jù)。

表3 輪葉黑藻組培苗各生長指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of growth indexes of tissue culture seedlings of H. verticillata

為模擬預(yù)測輪葉黑藻組培苗生長發(fā)育狀況，本研究利用Logistic、Gompertz、Von Bertalanffy 3種模型對輪葉黑藻組培苗的生長情況進行模擬，擬合方程、擬合參數(shù)、R2以及拐點等值如表4所示。

表4 三種“S”型模擬表達式Table 4 Three "S" type simulation expressions

輪葉黑藻組培苗生長發(fā)育的實際擬合曲線如圖1所示，圖中黑色實心圓點代表實際鮮重測量值，3種擬合曲線在第15 d的擬合值均低于實際測量值，且存在較大誤差率，隨著育苗時間的增加，代表組培苗鮮重實測值的黑點較為均勻的分布在擬合曲線周圍，尤其第25 d和第35 d，實測值幾乎與3種模型的擬合曲線重合，說明模型在此階段可高度模擬植物生長動態(tài)規(guī)律。

圖1 輪葉黑藻組培苗生長曲線擬合圖Fig.1 Growth curve fitting of H. verticillata tissue culture seedlings

為進一步比較各階段不同模型擬合效果，表5將組培苗鮮重實測值與模擬數(shù)據(jù)之間進行對比。第15 d、25 d、35 d、45 d、55 d時，Logistic模 型 擬合誤差率分別為54.05%、0.59%、4.26%、0.91%、0.15%。總體來看，隨著時間的增加，擬合誤差率逐步降低，曲線的擬合效果越好。分析原因可能是前期組培苗為適應(yīng)新環(huán)境，擾亂了自身正常生長秩序，而后期通過自我調(diào)節(jié)適應(yīng)新環(huán)境，恢復(fù)正常生長狀態(tài)(Smithers et al, 2019)。

表5 實測值與模型數(shù)據(jù)比較Table 5 Comparison of measured value and model data

2.3 組培苗開蓋煉苗生理指標(biāo)分析

光周期為6 h/d和12 h/d時，開蓋時間不會引起組培苗可溶性蛋白含量的顯著變化(圖2a)。當(dāng)光周期為9 h/d時，輪葉黑藻組培苗的可溶性蛋白含量在開蓋5 d時顯著上升了20.49%(P＜0.05)，同時其含量在該背景下達到了最大值1.73 mg/L。開蓋時間一定、光周期不同時，輪葉黑藻組培苗在9 h/d的光周期背景下，其可溶性蛋白含量均顯著高于其他兩組，當(dāng)開蓋時間為1 d、3 d、5 d時，相較于同一開蓋時間下的6 h/d與12 h/d兩組，輪葉黑藻組培苗可溶性蛋白含量均值分別提高了34.07%、56.32%。說明在9 h/d光周期的條件下，開蓋馴化5 d可使輪葉黑藻組培苗獲得較高可溶性蛋白含量。當(dāng)光周期為12 h/d時，與9 h/d組相比，該組可溶性蛋白含量均顯著下降，說明較長時間光照會降低輪葉黑藻組培苗的可溶性糖含量，與張愛玲(2009)對小麥的研究結(jié)果一致。孫歲寒等(2007)發(fā)現(xiàn)過長時間光照會影響藻細胞代謝抑制其生長，安彥君等(2016)也發(fā)現(xiàn)在24 h連續(xù)光照條件下，葛仙米的物質(zhì)積累出現(xiàn)負增長，說明長時間光照會損害植物生長發(fā)育。

圖2 輪葉黑藻組培苗可溶性蛋白（a）/糖含量（b）Fig.2 Soluble protein of H. verticillata tissue culture seedling(a)/ Soluble sugar(b)

光周期為6 h/d和12 h/d時，隨著開蓋時間的增加，輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量逐步降低但未形成顯著差異(圖2b)。在開蓋時間相同、光周期不同的條件下，輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量均呈現(xiàn)6 h/d＞9 h/d＞12 h/d的趨勢，但差異不顯著。研究表明：可溶性糖等活性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)宿主植物滲透壓，間接促進植物生長發(fā)育(Ribaut et al, 2002)，植物可以通過調(diào)整葉片中可溶性糖含量來提高自身的抗逆性(蘇雅等, 2021; 李婧等, 2021)，故本實驗中長光周期(12 h/d)不利于輪葉黑藻組培苗環(huán)境適應(yīng)能力的獲取。

3 結(jié)論

(1)在輪葉黑藻組培苗生長曲線擬合中，3種方程對其生長的擬合均具有較好效果，可一定程度上模擬其動態(tài)生長規(guī)律。46—48 d時間點附近是組培苗長勢最旺盛的階段，此階段及時移栽可以獲得長勢健壯的輪葉黑藻組培苗，從而避免過度培養(yǎng)帶來的出苗品質(zhì)不佳及經(jīng)濟損耗等問題。

(2)在輪葉黑藻組培苗開蓋煉苗過程中，煉苗條件對輪葉黑藻組培苗可溶性糖含量影響不大，但對其可溶性蛋白影響較大，且在長光周期(12 h/d)煉苗背景下會顯著降低組培苗可溶性蛋白含量，為保證組培苗煉苗效果，應(yīng)給予組培苗5 d開蓋露苗處理及9 h/d光周期處理。