嚴專強 麥凱杰 羅翠芬 周祺 楊德鴻 申翰欽 周慶豐

摘 要：為調(diào)查禽多殺性巴氏桿菌的流行情況，本研究從我國華東、華南和西南等區(qū)域8個省市家禽養(yǎng)殖場疑似禽霍亂發(fā)病群中分離出17株多殺性巴氏桿菌。血清型鑒定發(fā)現(xiàn)所有分離株均為莢膜A型。藥敏結(jié)果顯示分離株對阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢吡肟和復(fù)方新諾明等藥物敏感，對卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素和鏈霉素等藥物耐藥。

關(guān)鍵詞：多殺性巴氏桿菌;分離鑒定;血清型;耐藥性

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2021）11-0045-06

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida， PM）是引起禽類禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、牛羊出血性敗血癥等疾病的重要致病菌，家禽急性感染通?？梢姺尾砍鲅?，肝臟、脾臟有大量白色壞死點，死亡率較高[1]。多殺性巴氏桿菌的血清型根據(jù)莢膜抗原可分為A、B、D、E和F五個型，禽霍亂常由A和F型多殺性巴氏桿菌引起[2]。根據(jù)血清型制備滅活疫苗進行免疫是一種有效的預(yù)防措施，由于疫苗對異源血清型菌株的保護有限，因此監(jiān)測流行菌株的血清型非常有必要。臨床生產(chǎn)中多用抗生素進行治療，隨著菌株對常用藥物敏感性的降低，藥物治療越來越困難。本研究通過調(diào)查不同地區(qū)禽多殺性巴氏桿菌的流行血清型和耐藥情況，旨在為臨床禽霍亂疾病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

TSA（Tryptic Soy Agar）和TSB（Tryptic Soy Broth）培養(yǎng)基，購自美國BD公司;胎牛血清，購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司;2 × PCR mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;藥敏片，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 樣本采集與細菌分離

2018～2021年從浙江、福建、廣東、江蘇、四川、重慶、湖南和貴州8個省市的規(guī)模化養(yǎng)殖場采集疑似禽霍亂發(fā)病禽群肝臟或頭部樣品共17份，并將采集的樣品于2～8 ℃條件下當天帶回實驗室進行瑞氏染色鏡檢和細菌分離。

無菌使用接種環(huán)取樣品劃線于添加5%胎牛血清的TSA平板，于37 ℃條件下在5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～36 h，然后挑取大小均一的優(yōu)勢單菌落于添加5%胎牛血清的TSB培養(yǎng)基中放37 ℃搖床200 r/min純化培養(yǎng)12～24 h。

1.3 PCR鑒定

取純化培養(yǎng)的菌液制備DNA模板，以多殺性巴氏桿菌標準菌株CVCC 44801作為陽性對照，根據(jù)GenBank登錄號CP058991.1序列設(shè)計一對引物QI（表1），與文獻報道的引物（KMT）進行二重PCR鑒定[3]，同時出現(xiàn)與預(yù)期片段大小一致的兩條帶則可確診為多殺性巴氏桿菌。根據(jù)文獻報道[3]多殺性巴氏桿菌莢膜分型方法，合成相應(yīng)引物（表1）進行PCR鑒定分型，確定其莢膜血清型。菌液鑒定和莢膜分型PCR反應(yīng)條件均為：95 ℃預(yù)變性3 min;循環(huán)內(nèi)95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸按照1 000 bp延伸1 min，總35個循環(huán);72 ℃后延伸10 min。產(chǎn)物進行電泳后于凝膠成像儀觀察。

1.4 藥敏試驗

多殺性巴氏桿菌對營養(yǎng)有一定要求，因此本試驗使用添加5%胎牛血清的TSA平板進行藥敏試驗（K-B法）。將培養(yǎng)好的純化菌液調(diào)整濃度至OD600=0.08～0.13，使用滅菌棉簽將菌液均勻涂布于2塊TSA平板上，放置10～15 min后將阿莫西林、大觀霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、氨芐西林、頭孢吡肟、卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、強力霉素、復(fù)方新諾明和鏈霉素共12種抗生素藥敏片均勻貼于平板上，藥敏片之間至少間隔2 cm以上，于37 ℃條件下在5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～36 h。根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）的標準來判斷菌株耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 多殺性巴氏桿菌的分離鑒定

從浙江、福建、廣東、江蘇、四川、重慶、湖南、貴州8個省市的規(guī)?；B(yǎng)殖場共分離出17株多殺性巴氏桿菌，其中番鴨源分離株13株，黃羽肉雞源分離株4株（表2）。病料樣品瑞氏染色鏡檢可見大小不一、兩極濃染的短桿狀細菌，分離菌在TSA平板培養(yǎng)呈現(xiàn)透明的圓形、露珠狀菌落，見圖1。

2.2 PCR鑒定

特異性鑒定引物擴增結(jié)果顯示，分離菌株的QI引物擴增片段長度為305 bp，KMT引物擴增片段長度為460 bp，均與多殺性巴氏桿菌標準菌株CVCC 44801的標準陽性對照片段大小相符，鑒定確診為多殺性巴氏桿菌（圖2）。莢膜分型結(jié)果顯示所分離菌株擴增片段長度為1 044 bp，與預(yù)期的Type A擴增片段長度一致，結(jié)果表明分離的17種巴氏桿菌均為莢膜A型（圖3）。

2.3 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示，阿莫西林、頭孢曲松、頭孢吡肟、復(fù)方新諾明、氨芐西林對分離株抑菌效果最好，分別有100%、100%、100%、100%、94.1%的菌株敏感。對卡那霉素、四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素的耐藥菌株最多，占比分別為35.3%、35.3%、35.3%、29.4%（表3）。

3 討論

多殺性巴氏桿菌在養(yǎng)禽業(yè)中有著較大的危害，通常以散在爆發(fā)的形式流行于各個地區(qū)[4，5]。本研究分離的17株巴氏桿菌來自我國華東、華南和西南等區(qū)域8個省市的水禽和黃羽肉雞主養(yǎng)殖區(qū)，流行區(qū)域跨度較廣。從菌株分離時間來看，該疾病常年均可發(fā)生，但在高溫、高濕、多雨的夏秋季節(jié)分離率顯著升高。因此在該疾病流行區(qū)域，應(yīng)在高發(fā)時間段前，通過加強生物安全或疫苗免疫等方式著重進行預(yù)防。

本研究藥敏試驗結(jié)果顯示分離株對阿莫西林、頭孢曲松、復(fù)方新諾明等青霉素類、頭孢菌素類和磺胺類抗生素十分敏感，對卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素和四環(huán)素類抗生素較為耐藥。本研究藥敏結(jié)果與陶婭等[4]、Xiao等[5]報道的藥敏結(jié)果比較一致，與陳國權(quán)等[6]、王紅琳等[7]報道的藥敏試驗結(jié)果有很大不同，提示多殺巴分離株耐藥性存在差異，可能與不同區(qū)域養(yǎng)殖場的禽霍亂發(fā)病頻率和治療用藥習慣有關(guān)。

本研究揭示了我國部分地區(qū)禽巴氏桿菌的流行血清型和菌株耐藥情況，為禽霍亂疾病的免疫防控和藥物治療提供了數(shù)據(jù)參考。

參考文獻：

[1] WILKIE I W， HARPER M， BOYCE J D， et al. Pasteurella multocida： diseases and pathogenesis [J]. Curr Top Microbiol Immunol， 2012， 361： 1-22.

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[3] TOWNSEND K M， BOYCE J D， CHUNG J Y， et al. Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39： 924-929.

[4] 陶婭，王鉉皓，李軍朝，等.禽源多殺性巴氏桿菌的分離及生物學鑒定[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2019，55（04）：92-94.

[5] Xiao J F， Li Y J， Hu Z H， et al. Characterization of Pasteurella multocida isolated from ducks in China from 2017 to 2019[J]. Microb Pathogenesis， 2021，160： 105196.

[6] 陳國權(quán)，張旭，閻朝華，等. 鴨源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2020，47（02）：620-628.

[7] 王紅琳，盧琴，張騰飛，等.鴨源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2019，58（12）：116-119.