林敏娟 ，張晶晶 ，王建宇 ，王振磊 ，吳翠云 ，劉孟軍 *

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北 保定 071001；2.塔里木大學(xué)園藝與林學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3.南疆特色果樹(shù)高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

棗（Ziziphus jujubaMill.）為鼠李科棗屬植物，具有抗旱、耐鹽堿、生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，截止2017 年底，新疆棗種植面積為4.76×105hm2，產(chǎn)量為3.47×106t，棗已成為南疆主要的經(jīng)濟(jì)支柱［1］。但由于棗成熟期時(shí)常處于雨季，裂果的現(xiàn)象普遍存在，每年因裂果造成棗產(chǎn)量的損失大約為30%，嚴(yán)重的年份達(dá)80%以上，裂果嚴(yán)重影響和制約我國(guó)棗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。

棗果皮中的纖維素、半纖維素以及果膠共同組成細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞穩(wěn)定及完整性［2］。原果膠為果膠中的主要成分，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞主要是因?yàn)槔w維素酶及果膠酶可將無(wú)定形纖維素和原果膠水解為纖維寡糖和小分子物質(zhì)，致使果皮強(qiáng)度降低，裂果率升高［3，4］。易裂西瓜瓜皮中的果膠酶、纖維素酶及POD 活性顯著高于抗裂的小型西瓜［5］。易裂品種壺瓶棗［6］的原果膠及纖維素含量在果實(shí)發(fā)育后期降低，裂果率升高。

果實(shí)內(nèi)部遺傳因素也是引起果實(shí)裂果的重要因素之一，果實(shí)內(nèi)部基因變化可能引起果實(shí)結(jié)構(gòu)及硬度的變化，細(xì)胞壁擴(kuò)張蛋白是與裂果關(guān)系較為密切的細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因［7］，抑制番茄PG和EXP基因表達(dá)可使PG 和EXP 蛋白含量降低，果皮中水溶性果膠含量減少，細(xì)胞壁厚度及硬度均增加，裂果率降低［8］。辛海清［9］研究發(fā)現(xiàn)抗裂棗品種‘皖棗3 號(hào)’果皮中擴(kuò)張蛋白EXPA類基因表達(dá)量顯著高于棗易裂果品種‘李府貢棗’。魏琦琦［10］發(fā)現(xiàn)PG和LOX基因可能與中秋酥脆棗裂果有關(guān)。

目前關(guān)于棗裂果研究多數(shù)集中在果皮解剖結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁物質(zhì)含量、植物內(nèi)源激素等生理生化方面，本課題組研究通過(guò)對(duì)伏脆蜜不同裂果部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，得到5 個(gè)差異表達(dá)基因（AUX/IAA、ARF、SAUR、JAZ、GH3.1）主要調(diào)控植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；2 個(gè)差異表達(dá)基因（Endo?glucanase12、Pectinesterase17）調(diào)控纖維素酶及果膠酶活性；3 個(gè)差異表達(dá)基因（POD17、POD4、POD51）主要富集合成木質(zhì)素［11］。這 10 個(gè)基因可能與‘伏脆蜜’裂果有關(guān)，但研究還不夠深入、系統(tǒng)，生理生化指標(biāo)與裂果基因關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以‘伏脆蜜’為試材，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，探討‘伏脆蜜’裂果發(fā)生前后果皮中纖維素、半纖維素、果膠含量，纖維素酶、半纖維素酶、POD 活性，IAA、ABA 及 GA3含量與基因表達(dá)的關(guān)系，為棗裂果分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019 年在塔里木大學(xué)棗種質(zhì)資源圃進(jìn)行，供試品種為易裂果品種‘伏脆蜜’，樹(shù)齡10 年，田間常規(guī)管理，水肥管理?xiàng)l件一致。盛花后40~50 d 為棗果綠熟期，此時(shí)期棗果還未定型；盛花后60~70 d 左右為棗果白熟期；盛花后80 d 左右為果實(shí)脆熟期；盛花后90 d 棗果實(shí)全紅；盛花后70~80 d 為“裂果初發(fā)期”，盛花后80~90 d 為“裂果高發(fā)期”，盛花后90 d 為裂果末期。

1.2 試驗(yàn)方法

選擇6 株長(zhǎng)勢(shì)大致相同的棗樹(shù)，2019 年6 月棗樹(shù)盛花期對(duì)樹(shù)冠外圍、生長(zhǎng)健壯棗吊中部的花進(jìn)行掛牌標(biāo)記，盛花期后40 d 起，每隔10 d 從東南西北每個(gè)方向采摘15 個(gè)完好無(wú)損的果實(shí)，用蒸餾水清洗干凈，取果皮，液氮快速冷凍后裝入自封袋，?80℃超低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 細(xì)胞壁物質(zhì)含量測(cè)定

纖維素、半纖維素含量采用蒽酮比色法，果膠物質(zhì)含量采用咔唑硫酸比色法［11］。

稱取2 g 果皮，液氮研磨，80%乙醇定容至10 mL，沸水浴煮 20 min，室溫冷卻，于 6 000 r·min-1離心10 min，棄上清液（重復(fù)5~6 次），直至提取液中檢測(cè)不到糖為止，用10 mL 90%的二甲基亞砜于4℃浸泡15 h 以除去淀粉，加入10 mL 氯仿∶甲醇（1∶1）沖洗濾渣，再用 10 mL 丙酮重復(fù)離心，洗滌沉淀，于45 ℃下干燥至恒重，得到粗細(xì)胞壁，用于測(cè)定纖維素、半纖維素、果膠物質(zhì)含量。

1.2.2 細(xì)胞壁代謝酶活性測(cè)定

POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚氧化法，纖維素酶和果膠酶活性測(cè)定采用DNS 終止反應(yīng)法［11］。

POD 活性測(cè)定：取果皮0.5 g 置于研缽中，加入 2.5 mL 0.1 mol·L-1pH 7.2 的 磷 酸 緩 沖 液 ，少量石英砂以及聚乙烯吡咯烷酮研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入10 mL 離心管中，用2.5 mL PBS 沖洗研缽2~3次，合并提取液，于 4 ℃，5 000 r·min-1離心 15 min獲得粗酶液。

纖維素酶和果膠酶活性測(cè)定：取棗果皮1 g 置于研缽中，加 1 mL 預(yù)冷的 0.1 mol·L-1pH 7.6 的醋酸鈉緩沖液冰浴研磨成勻漿，勻漿倒入10 mL離心管中，用醋酸緩沖液依次加1 mL 沖洗3 次，4 ℃提取 1 h，4 ℃1 000 r·min-1離心 20 min 得上清液（粗酶液）。

1.2.3 內(nèi)源激素的測(cè)定

采用高效液相色譜法［12］測(cè)定棗果皮中IAA、ABA、GA3含量，略有改動(dòng)。

1.2.4 基因表達(dá)量的測(cè)定

使用TIANGEN 公司的RNAprep Pure Plant Plus Kit（Polysaccharides&Polyphenolices-rich）提取棗果皮中總RNA，用RNase-Free DNase I（TIANGEN，中國(guó)）處理去除基因組DNA，按照FastQuant RT Super Mix FastQuant cDNA 試劑盒（TIANGEN，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)將RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA。按照 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（TIANGEN，中 國(guó)）試 劑 盒 和 使 用QUANT 5 定 量 PCR 進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)。

SuperReal PreMix Plus（SYBR Gree）試劑盒反應(yīng)體系如下：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL，F(xiàn)-primer 0.3 μL，R-primer 0.3 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free ddH2O 10 μL，按照程序：95 ℃ 15 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s 變性，60 ℃ 20 s 退火，72 ℃ 20 s延伸，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因重復(fù)3 次。使用2-△△CT法計(jì)算出基因相對(duì)表達(dá)量。PCR 特異性引物和內(nèi)參基因引物見(jiàn)表1。

表1 相關(guān)基因qRT?PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of related genes QRT?PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用 Microsoft Excel 2010 和 DPS 7.55 軟 件對(duì)數(shù)據(jù)整理作圖及分析，用多重比較中的Duncan新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮細(xì)胞壁物質(zhì)含量的變化

如圖1 所示，在棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮中纖維素、WSP、ISP 和總果膠含量呈‘W’型變化趨勢(shì)（圖1A、B、C、D）。裂果初發(fā)期呈下降趨勢(shì)，在裂果高發(fā)期呈上升趨勢(shì)，裂果末期纖維素、ISP 及總果膠含量最高，分別是3.60%，2.19%，6.74%。半纖維素（圖1E）含量在裂果初發(fā)期含量最高0.71%，裂果末期半纖維素含量相比裂果初發(fā)期降低44%。 CSP（圖1F）含量在白熟期含量最低1.84%，在裂果高發(fā)期含量變化較為平穩(wěn)。這表明細(xì)胞壁物質(zhì)含量與裂果關(guān)系較為密切。

圖1 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮細(xì)胞壁物質(zhì)含量變化Fig.1 Changes of pericarp cell wall substance content during fruit development of Jujube

2.2 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮細(xì)胞壁代謝酶活性變化

如圖2 所示，在裂果發(fā)生前后，POD 在盛花期后 50 d 和 70 d 時(shí)酶活性高達(dá) 89.91 U·g-1和 86.41 U·g-1，裂果期酶活性快速降低。纖維素酶在盛花期后 70 d 酶活性最大，為 2 363.47 U·g-1，裂果期酶活性逐漸降低，裂果末期酶活性相比裂果初期酶活性降低25.01%。果膠酶活性在裂果發(fā)生前后變化不大。

圖2 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮細(xì)胞壁代謝酶活性變化Fig.2 Changes of metabolic enzyme activity of pericarp cell wall during fruit development of Jujube

2.3 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮激素含量變化

如圖3 所示，裂果發(fā)生前后GA3含量在裂果發(fā)生前后呈‘上升-下降’的趨勢(shì)，白熟期GA3含量最高，高達(dá) 173.72 ng·g-1，整個(gè)裂果期間 GA3含量降低了27.62%；盛花后90 d IAA 含量相比盛花后40 d 下降了79.74%；ABA 含量在裂果發(fā)生前后變化較為平穩(wěn)。

圖3 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果皮激素含量變化Fig.3 Variation of hormone content in pericarp of Jujube during fruit development

2.4 調(diào)控果皮細(xì)胞壁代謝酶及內(nèi)源激素的基因表達(dá)量變化

2.4.1 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中調(diào)控果皮POD 活性的基因表達(dá)量變化

如圖4 所示，隨著‘伏脆蜜’果實(shí)開(kāi)始開(kāi)裂，棗裂果時(shí)期調(diào)控相關(guān)POD 活性的POD17、POD4、POD51三個(gè)基因表達(dá)量顯著低于未裂果時(shí)期，裂果末期基因表達(dá)量相比與裂果初期基因表達(dá)量相比，分別降低76.05%、98.11%、95.49%。

圖4 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中相關(guān)POD 基因表達(dá)量分析Fig.4 Analysis of POD gene expression levels during fruit development in Jujube

2.4.2 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中調(diào)控果皮細(xì)胞代謝酶的基因表達(dá)量變化

如圖5 所示，Endoglucanase12基因在盛花期后70 d 基因表達(dá)量為5.97，裂果時(shí)期基因表達(dá)量直線下降。Pectinesterase17基因在盛花后80 d 和90 d 的基因表達(dá)量分別是盛花后70 d 基因表達(dá)量的 17.98 倍 和 15.69 倍 。

圖5 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞代謝酶相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig.5 Analysis of expression levels of metabolic enzymes related genes in Jujube fruit development

2.4.3 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中調(diào)控果皮激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因表達(dá)量變化

如圖 6 所示，調(diào)控ARF、JAZ、SAUR的基因表達(dá)量在裂果初期表達(dá)量最高，表達(dá)量分別為4.17、2.39、6.27。在裂果高發(fā)期3 個(gè)基因表達(dá)量迅速下降且維持在較低水平。AUX/IAA和GH3.1基因表達(dá)量在未裂果時(shí)期基本未發(fā)生變化，在裂果期2個(gè)基因表達(dá)量快速上升，分別在盛花后90 d 和80 d基因表達(dá)量達(dá)到最大值。

圖6 棗果實(shí)發(fā)育過(guò)程中相關(guān)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)量分析Fig.6 Analysis of expression levels of related hormone signal transduction genes during fruit development in Jujube

3 討論

3.1 細(xì)胞壁物質(zhì)與裂果的關(guān)系

原果膠、纖維素、半纖維素等多糖類物質(zhì)共同構(gòu)成植物細(xì)胞的細(xì)胞壁［13］。原果膠含量、纖維素排列方式和半纖維素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均可增強(qiáng)細(xì)胞壁強(qiáng)度、韌性以及延展性［14］。隨果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，原果膠可降解為水溶性果膠，原果膠含量降低，抗裂品種‘婆婆棗’CSP、WSP 及ISP 含量極顯著高于易裂品種‘壺瓶棗’［15］。本研究發(fā)現(xiàn)‘伏脆蜜’裂果期果皮中CSP 含量無(wú)顯著變化，裂果初期棗果皮中WSP、ISP 及總果膠含量下降，裂果高發(fā)期上升。裂果期半纖維素降低，與趙麗琴［2］的研究結(jié)果一致。

3.2 細(xì)胞壁代謝酶及相關(guān)基因與裂果的關(guān)系

POD 為細(xì)胞壁氧化酶，主要與植物組織分化和果實(shí)成熟等有關(guān)。POD 可通過(guò)催化各種木質(zhì)醇單體發(fā)生脫氫聚合反應(yīng)，參與細(xì)胞壁內(nèi)木質(zhì)素合成［16］。較高木質(zhì)素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁木質(zhì)化程度增加，延展性降低，裂果率增加。易裂品種壺瓶棗果實(shí)中POD 活性隨棗果生長(zhǎng)發(fā)育呈下降趨勢(shì)［6］，本研究發(fā)現(xiàn)‘伏脆蜜’裂果期果皮中POD 活性，富集合成木質(zhì)素的POD17、POD4、POD51基因表達(dá)量快速下降，此3 個(gè)基因可能相互調(diào)控POD 活性。纖維素酶及果膠酶可水解果皮中的纖維素及果膠從而降低果皮的機(jī)械強(qiáng)度，導(dǎo)致果實(shí)的易裂性［17］。裂果期‘伏脆蜜’棗果皮中纖維素酶活性顯著下降，與栗現(xiàn)芳在“駿棗”上的結(jié)果一致［18］。調(diào)控纖維素酶活性基因Endoglucanase12表達(dá)量在裂果期快速下降。此基因可能在纖維素降解過(guò)程中扮演重要角色，從而導(dǎo)致纖維素含量改變。果膠酶可通過(guò)分解細(xì)胞壁中果膠影響細(xì)胞壁穩(wěn)定性，導(dǎo)致裂果增加。易裂荔枝品種“糯米滋”果膠酶活性較高［19］，而‘伏脆蜜’果皮中果膠酶活性白熟期至裂果期下降幅度較小。果膠甲酯酶基因在駿棗果實(shí)中表達(dá)量較高［20］，‘伏脆蜜’棗果皮中調(diào)控果膠酶活性的Pectinesterase17基因裂果期表達(dá)量極顯著高于未裂果期。

3.3 激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及相關(guān)基因與裂果的關(guān)系

生長(zhǎng)素、赤霉素是生長(zhǎng)促進(jìn)類激素，在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育前期可加速細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)速度，脫落酸是生長(zhǎng)抑制激素，調(diào)控植物器官衰老發(fā)育進(jìn)程［21］。果實(shí)裂果與生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸密切相關(guān)。棗果實(shí)發(fā)育前期高含量IAA 及GA3可促進(jìn)細(xì)胞分裂及生長(zhǎng)，而果皮細(xì)胞在果實(shí)發(fā)育后期停止生長(zhǎng)，果肉細(xì)胞易吸水膨脹，導(dǎo)致裂果［22］。楊俊強(qiáng)［23］研究發(fā)現(xiàn)易裂品種‘壺瓶棗’內(nèi)源GA3含量顯著低于抗裂品種‘官灘棗’。隨著棗果生長(zhǎng)發(fā)育成熟，高含量ABA 可加速細(xì)胞衰老，果皮組織軟化導(dǎo)致裂果，易裂品種‘駿棗’ABA 含量在裂果高發(fā)期顯著高于抗裂品種‘圓鈴棗’［24］。本研究發(fā)現(xiàn)盛花期后60~90 d‘伏脆蜜’果皮中GA3及IAA 含量呈下降趨勢(shì)，ABA 含量裂果前后變化不大。

JA（茉莉酸）是一類新型與自身防御系統(tǒng)有關(guān)的植物內(nèi)源生長(zhǎng)物質(zhì)，在受到外界不利因素侵害時(shí)，可誘導(dǎo)植物防御基因表達(dá)以及防御化學(xué)物質(zhì)的合成［25］。楊育［13］在梨上研究發(fā)現(xiàn)編碼JA合成關(guān)鍵酶及生長(zhǎng)素AUX/IAA轉(zhuǎn)錄因子的基因在裂果果皮中下調(diào)表達(dá)，裂果果皮中GH3轉(zhuǎn)錄因子和SAUR轉(zhuǎn)錄因子的基因與正常果皮相比上調(diào)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)‘伏脆蜜’棗裂果期JAZ、ARF、SAUR下調(diào)表達(dá)，AUX/IAA、GH3.1上調(diào)表達(dá)。

4 結(jié)論

POD17、POD4、POD51、Endoglucanase12、JAZ、ARF、SAUR基因表達(dá)量在裂果期快速下降，裂果期Pectinesterase17、AUX/IAA、GH3.1表達(dá)量極顯著高于未裂果期。POD、纖維素酶活性在棗裂果期快速下降，纖維素酶加速纖維素及半纖維素分解，纖維素含量在裂果初期下降，半纖維素含量在裂果期快速下降，細(xì)胞壁穩(wěn)定性變差，裂果增加，POD17、POD4、POD51、Endoglucanase12低表達(dá)與‘伏脆蜜’POD 及纖維素酶活性密切相關(guān)。Pectinesterase17與果膠酶的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。果皮中GA3及IAA 含量在裂果期下降，而ABA 含量上升，激素與相關(guān)基因之間的具體關(guān)系仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。