覃鑫浩，梁艷，陳超凡，覃林,3＊

(1.國家林業(yè)和草原局調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，北京 100714；2.廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

人工林是世界森林資源的重要組成部分，在木材供給、改善生態(tài)環(huán)境和應(yīng)對氣候變化等方面發(fā)揮重要作用。隨著中國對木材需求日益增長及生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識的不斷提高，大規(guī)模的造林和再造林促使中國人工林面積繼續(xù)保持世界首位[1-2]。我國南亞熱帶地區(qū)氣候條件優(yōu)越，是重要的商品用材林基地，多年來大面積多代連栽的馬尾松（Pinus massonianaLamb.）、杉木（Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）等人工針葉純林以及外來速生樹種桉樹（Eucalyptus）等短輪伐期工業(yè)用材林，為區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民脫貧致富做出了重大貢獻(xiàn)；但這些人工純林極易造成土壤肥力衰退、生物多樣性下降及病蟲害日益嚴(yán)重等生態(tài)環(huán)境問題[3-5]。因此，當(dāng)前倡導(dǎo)并實(shí)施人工林生態(tài)系統(tǒng)適應(yīng)性經(jīng)營亟需解決的關(guān)鍵問題，是如何科學(xué)合理地營造和經(jīng)營管理人工林，從而有效提高其生產(chǎn)力并維持多重生態(tài)服務(wù)功能。建立鄉(xiāng)土闊葉人工林可以兼顧珍貴用材生產(chǎn)、生物多樣性保護(hù)、生態(tài)功能和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性改善[1]。采用紅錐（Castanopsis hystrixMiq.）、米老排（Mytilaria laosensisLec.）、火力楠（Michelia macclureiDandy）和山白蘭（Paramichelia bailonii(Pierre) Hu）等不同生物學(xué)特性的鄉(xiāng)土珍貴闊葉樹種造林已成為我國亞熱帶地區(qū)人工林經(jīng)營的發(fā)展趨勢[6]。

細(xì)菌是土壤中數(shù)量最多、分布最廣并參與土壤有機(jī)質(zhì)分解和礦化過程的主要微生物，在土壤結(jié)構(gòu)形成與土壤肥力調(diào)節(jié)等方面起極其重要作用[7]。土壤細(xì)菌群落多樣性是評價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，土壤中細(xì)菌群落多樣性愈高，越有利于提高土壤恢復(fù)力與抗壓力[8]。土壤細(xì)菌群落從土壤有機(jī)質(zhì)的分解和礦化中獲取能量，且土壤的碳、氮和磷供給對細(xì)菌多樣性有顯著影響[9-10]。樹種可通過其凋落物和根系分泌物等影響土壤理化性質(zhì)[11-13]，而土壤性質(zhì)的改變會驅(qū)動(dòng)土壤微生物群落組成和多樣性的響應(yīng)[14-15]。譚宏偉等[16]基于PCR-DGGE 技術(shù)比較分析了廣西紅壤區(qū)桉樹人工林、馬尾松人工林和天然闊葉林對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，羅達(dá)等[17]運(yùn)用磷脂脂肪酸法(PLFAs) 研究了我國南亞熱帶格木（Erythrophleum fordiiOliv.）、馬尾松人工純林及二者混交林林地土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)特征，黃雪蔓等[18]采用磷脂脂肪酸法探究了固氮樹種對第2 代桉樹人工林土壤微生物生物量和結(jié)構(gòu)的影響。然而，有關(guān)我國南亞熱帶地區(qū)不同造林樹種，尤其是鄉(xiāng)土樹種與外來樹種對林地土壤細(xì)菌群落多樣性影響的比較研究甚少。

本文以位于廣西憑祥市中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心的馬尾松、紅錐、米老排、火力楠和尾巨桉（Eucalyptus urophylla×E.grandis）等不同樹種人工林為研究對象，利用PCR-DGGE 技術(shù)分析不同樹種人工林對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，并探討土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)因子之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在提高對人工林土壤細(xì)菌多樣性變化規(guī)律的認(rèn)識，以期為該地區(qū)倡導(dǎo)并實(shí)施人工林生態(tài)系統(tǒng)適應(yīng)性經(jīng)營策略的樹種選擇提供土壤微生物生態(tài)學(xué)方面的理論依據(jù)。

1 研究區(qū)及樣地概況

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)地處廣西憑祥市中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心伏波試驗(yàn)場（106°51′～106°53′ E，22°02′～22°04′ N），該地區(qū)屬于南亞熱帶季風(fēng)區(qū)，為半濕潤-濕潤氣候，干濕季節(jié)明顯。年平均氣溫20.5～21.7℃，年平均降水量1 200～1 500 mm，年均蒸發(fā)量1 261～1 388 mm，空氣相對濕度80%～84%。該地區(qū)地貌類型以低山丘陵為主，海拔430～680 m，土壤類型為紅壤，土層厚度大于80 cm，pH 值為4.8～5.5[19]。

1.2 樣地概況

2014年8月在研究區(qū)選取立地條件和經(jīng)營措施相似的馬尾松、紅錐、米老排和火力楠等4種鄉(xiāng)土樹種人工林以及外來速生尾巨桉人工林為研究對象，其中，馬尾松、紅錐人工林于1983年?duì)I造，并分別于1993、1998、2009年進(jìn)行了3 次間伐（強(qiáng)度約30%）；米老排、火力楠人工林在1981年種植，分別于1993年和2003年進(jìn)行了2 次間伐（強(qiáng)度約30%）；尾巨桉人工林為2008年?duì)I造。上 述5種林分均是在杉木人工林皆伐跡地上營建，初植密度均為2 500株·hm?2。5種林分的平均樹高、平均胸徑、保留株數(shù)如下：馬尾松林的分別為19.4 m、29.2 cm、1 470株·hm?2，紅錐林的分別為17.1 m、23.4 cm、1 075株·hm?2，米老排林的分別為19.7 m、19.2 cm、1 208株·hm?2，火力楠林的分別為18.0 m、17.4 cm、1 225株·hm?2，桉樹林的分別為16.9 m、11.1 cm、2 300株·hm?2。

2 研究方法

2.1 土壤樣品采集

在5種人工林中按上、中、下坡位各設(shè)置1個(gè)20 m×20 m 的樣地，并進(jìn)行林分調(diào)查。在每個(gè)樣地內(nèi)的對角線上隨機(jī)選取3個(gè)土壤采集點(diǎn)，挖取0～20 cm 土層土壤剖面，將3個(gè)取樣點(diǎn)土壤充分混合形成一個(gè)土壤樣品，然后將這個(gè)土壤樣品分成3 份。一份裝入鋁盒用于測定土壤含水量；另一份裝入布袋用于測定土壤化學(xué)性質(zhì)；第三份裝入聚乙烯保鮮袋并用生物冰袋保存帶回實(shí)驗(yàn)室，挑出土壤樣品中大的石礫、植物根系等雜物后過2 mm篩，放入?80℃超低溫冰箱保存用于土壤細(xì)菌多樣性測定。

2.2 土壤理化性質(zhì)的測定

土壤含水量（SWC）采用烘干法測定，pH 值采用電位法測定（水:土為2.5:1）（Prtavo 907 MULTI pH，德國），土壤總碳（TC）含量采用Multi N/C 3100 TOC 分析儀（Analytik Jena，德國）測定，全氮（TN）含量采用H2SO4-HClO4消解后用SmartChem200 全自動(dòng)化學(xué)元素分析儀（Alliance，法國）測定，土壤硝態(tài)氮（NO3?-N）和銨態(tài)氮（NH4+-N）含量采用SmartChem200 全自動(dòng)分析儀（Alliance，法國）測定，土壤全磷（TP）含量采用酸溶-鉬銻抗比色法測定，有效磷（AP）含量采用鹽酸-氟化銨法測定，全鉀（TK）含量采用氫氧化鈉堿熔-火焰光度法測定，速效鉀（AK）含量采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定[20]。土壤有效氮（AN）含量為硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量總和。

2.3 土壤微生物基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和DGGE 分析

將新鮮土壤樣本采用PowerSoil?DNA Isolation Kit 試劑盒（MoBio，USA）進(jìn)行基因組抽提，并取3 μL 基因組DNA 采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定基因組DNA 是否可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以提取的土壤微生物DNA 為模板，采用PCR 對土壤細(xì)菌16S rRNA V3 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，其上游引物為357 F-GC（序列為CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG）和下游引物518 R（序列為ATTACCGCGGCTGCTGG）[16]。第1 次PCR 擴(kuò)增體系為：BioLinker 2×Taq Mix 20 μL，引物上游和下游各1 μL，DNA模板1 μL，補(bǔ)ddH2O 至40 μL；其擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃、2 min，然后94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s，25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收?；厥债a(chǎn)物進(jìn)行二次PCR 擴(kuò)增。第2 次PCR 擴(kuò)增體系為：BioLinker 2×Taq Mix 20 μL，引物上游和下游各2 μL，DNA模板4 μL，補(bǔ)ddH2O 至40 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃、2 min，然后94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s，5個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析：采用Bio-Rad 公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。樣品在變性劑濃度50%～75%（100% 的變性膠為7 mol·L?1的尿素和40% 的去離子甲酰胺的混合物）的8%丙烯酰胺凝膠中，在70 V 的恒定電壓下，60℃電泳15.5 h。電泳完畢后，加入400 mL Biolinker DNA Red 染色液進(jìn)行染色40 min 后置于Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。上述土壤細(xì)菌DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和DGGE分析由微基生物科技（上海）有限公司完成。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Quantity One 分析軟件（Bio-Rad）對各土壤樣品的電泳條帶數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分別計(jì)算不同林分土壤細(xì)菌群落的豐富度（S）、Shannon指數(shù)（H）、Simpson 指數(shù)（D）和均勻度（EH）等多樣性指數(shù)[21]。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）及Duncan 多重比較方法檢測不同林分之間土壤理化性質(zhì)參數(shù)、細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的差異顯著性（p<0.05）。在分析前，對各變量指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)分布（Shapire-Wilk test）及方差齊性檢驗(yàn)（Levene test），若不滿足則對數(shù)據(jù)進(jìn)行Box-Cox 變換。采用Pearson 相關(guān)性分析土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性。上述計(jì)算由IBM SPSS 24.0 軟件完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同樹種人工林的土壤理化性質(zhì)

從表1 可知：5種人工林的土壤總碳含量差異不顯著（p>0.05）；尾巨桉人工林的土壤含水量、pH、全鉀和速效鉀含量明顯高于4種鄉(xiāng)土樹種人工林，但其土壤全磷和有效磷含量卻低于4種鄉(xiāng)土樹種人工林；4種鄉(xiāng)土樹種人工林相比，馬尾松林具有較低的土壤含水量、pH、全氮和有效磷含量，火力楠林卻擁有較高的土壤全氮、全磷、全鉀、有效氮和速效鉀含量，紅錐林的土壤全鉀、有效氮和速效鉀含量最低，而米老排林具有最高的土壤含水量。

表1 5種人工林土壤理化性質(zhì)比較分析（n=3）Table 1 Comparative analysis of soil physicochemical properties among five different planted forests（n=3）.

3.2 土壤細(xì)菌群落的多樣性

3.2.1 總DNA 提取和PCR 擴(kuò)增檢測 從5種人工林土壤樣品提取的微生物基因組總DNA 中各取3 μL用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果（圖1a）顯示：DNA Marker 條帶亮度較好，且無明顯拖帶現(xiàn)象，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。從土壤細(xì)菌16S rRNA 的V3 可變區(qū)第2 次PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物各取4 μL 于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖1b）可知：PCR 擴(kuò)增后的DNA 片段長度在250 bp 左右，且無雜帶，說明提取的DNA 方法適合PCR 擴(kuò)增，可以直接進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 5種林分土壤細(xì)菌總DNA 的瓊脂糖電泳圖譜（a）和土壤細(xì)菌16S rRNA 基因V3 區(qū)的第2 次PCR 擴(kuò)增片段圖譜（b）Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total DNA extracted from the soil bacteria(a) and the PCR amplified fragment 16S rRNA (V3) gene of the soil bacteria (b) collected from the five different tree species plantations

3.2.2 土壤細(xì)菌群落DGGE 圖譜分析運(yùn)用DGGE 技術(shù)將各土壤樣品中細(xì)菌的16S rRNA 基因V3 片段PCR 產(chǎn)物分離出數(shù)目不等的電泳條帶（圖2a），經(jīng)過Quantity One 軟件將原DGGE 膠圖轉(zhuǎn)換成直觀的條帶分布圖（圖2b）。在圖2b中，位于同一水平線的為相同物種，而左右兩側(cè)的數(shù)字為經(jīng)分析后該板膠共有的條帶數(shù)（也可認(rèn)為是該板膠上所有樣本包含的物種數(shù)），最下面一行的百分?jǐn)?shù)是以第1個(gè)樣本為基準(zhǔn)的前提下，其余樣本與第1 樣本的相似性。根據(jù)DGGE 技術(shù)可以將長度相同而序列不同的DNA 分離的原理，DGGE 膠中條帶數(shù)量越多，說明微生物種類豐富度越高[22]。5種林分土壤細(xì)菌DGGE 圖譜的條帶數(shù)量順序?yàn)椋好桌吓帕郑?5.67） >紅錐林（45.33） >馬尾松林（43.00） >火力楠林（40.67） >尾巨桉林（40.00）（表2）。

圖2 不同林分土壤細(xì)菌群落的DGGE 膠圖（a）和條帶分布圖(b)Fig.2 The DGGE profile (a) and strip distribution (b) of soil bacterial communities in different planted forests

3.2.3 土壤細(xì)菌群落多樣性 根據(jù)16S rRNA 的PCR-DGGE 圖譜中條帶的位置和亮度的數(shù)值化結(jié)果，計(jì)算各林分土壤細(xì)菌群落的豐富度、Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)和均勻度（表2）。由表2 可知：各多樣性指數(shù)在5種林分間的差異不顯著（p>0.05），但尾巨桉林土壤細(xì)菌群落的各多樣性指數(shù)均略低于4種鄉(xiāng)土樹種人工林。

表2 不同林分土壤細(xì)菌群落多樣性比較（n=3）Table 2 Comparison of soil bacterial community diversity for different studied plantations（n=3）

3.3 土壤細(xì)菌群落多樣性和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

土壤樣品的細(xì)菌群落多樣性指標(biāo)與土壤理化性質(zhì)參數(shù)的Pearson 相關(guān)分析（表3）表明：5種林分土壤細(xì)菌群落的Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和均勻度與土壤全氮顯著正相關(guān)（p<0.05），而其Simpson 指數(shù)和均勻度與土壤全磷顯著正相關(guān)（p<0.05）。

表3 土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)的Pearson 相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson correlation coefficient between diversity indices of soil bacterial community and soil physicochemical properties

4 討論

在我國南亞熱帶地區(qū)，將針葉或外來速生樹種人工林轉(zhuǎn)變?yōu)猷l(xiāng)土闊葉樹種后其人工林生態(tài)系統(tǒng)功能的變化已引起生態(tài)學(xué)者關(guān)注[4,23]。本文利用PCRDGGE 技術(shù)，探討馬尾松、紅錐、米老排和火力楠等4種鄉(xiāng)土樹種人工林及外來樹種尾巨桉人工林對林地土壤（0～20 cm）細(xì)菌群落多樣性的影響，結(jié)果表明，尾巨桉林土壤細(xì)菌群落的豐富度、Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)和均勻度與4種鄉(xiāng)土樹種人工林之間的差異不顯著（p>0.05），這與譚宏偉等[16]關(guān)于廣西紅壤區(qū)桉樹人工林土壤細(xì)菌豐富度、多樣性指數(shù)以及均勻度皆與鄉(xiāng)土樹種馬尾松人工林之間無顯著差異的結(jié)論基本一致。

不同的植物凋落物數(shù)量和質(zhì)量以及根系分泌物化學(xué)特性的不同必然引起土壤理化性質(zhì)的變化，進(jìn)而引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的改變[24-25]。土壤氮素是土壤細(xì)菌的重要營養(yǎng)來源，而土壤中的全氮是衡量土壤氮素供應(yīng)狀況的重要指標(biāo)[26]。白曉旭等[27]研究認(rèn)為，全氮是影響河南寶天曼自然保護(hù)區(qū)不同林齡銳齒櫟（Quercus alienaBl.var.acuteserrataMaxim.ex Wenz）及不同林分類型（短柄枹（Quercus glanduliferavar.brevipetiolataNakai）林、栓皮櫟（Quercus variabilisBl.）林、銳齒櫟/華山松（Pinus armandiiFranch.）混交林和80年生銳齒櫟林）土壤細(xì)菌群結(jié)構(gòu)變化的重要因子，且隨全氮含量的增加，土壤菌群物種多樣性呈增加趨勢；朱平等[28]發(fā)現(xiàn)，祁連山不同植被類型（墊狀植被、高寒草甸、沼澤化草甸和高寒灌叢）土壤微生物群落多樣性與全氮顯著正相關(guān)（p<0.05）。本研究中，5種人工林土壤細(xì)菌多樣性與土壤全氮顯著正相關(guān)（p<0.05），與上述研究結(jié)果基本一致。此外，土壤中磷素也是土壤細(xì)菌的重要營養(yǎng)來源，但是土壤中的磷素大部分以遲效性狀態(tài)存在，全磷含量高并不意味著磷素供給充足，而全磷含量低于某一水平時(shí)卻可能意味著磷素供應(yīng)不足[29]。我國土壤全磷含量為0.2～1.1 g·kg?1，若全磷含量低于0.4 g·kg?1則有可能磷供應(yīng)不足[20]。本研究中，5種人工林土壤全磷含量（0.12～0.30 g·kg?1）低于0.4 g·kg?1，導(dǎo)致土壤全磷成為細(xì)菌在土壤中生存和繁殖的影響因子，這可能是5種林分土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤全磷顯著正相關(guān)的緣故。

在森林生態(tài)系統(tǒng)中，由于水分、養(yǎng)分、通氣、溫度、pH 值等因子在土壤剖面上存在差異，導(dǎo)致土壤細(xì)菌多樣性也存在某種程度上的差別[30-31]。張社奇等[32]在研究黃土高原刺槐（Robinia pseudoacaciaLinn.）林地土壤微生物垂直分布時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤深度對細(xì)菌數(shù)量的分布具有顯著影響；杜璨等[33]探討了紅樺（Betula albosinensisBurk.）林4個(gè)土壤層（0～10、10～20、20～40、40～60 cm）細(xì)菌群落豐富度、多樣性指數(shù)和細(xì)菌群落組成及豐度變化；彭雯等[6]指出，不同土層（0～20、20～40 cm）在門、綱、目分類水平上均表現(xiàn)出桉樹林土壤細(xì)菌群落組成與其他5種鄉(xiāng)土樹種（紅錐、米老排、火力楠、山白蘭和馬尾松）人工林存在明顯差異。然而，本文僅討論了南亞熱帶5種不同樹種人工林對0～20 cm 土層細(xì)菌群落的豐富度、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和均勻度的影響，那么這5種人工林之間土壤細(xì)菌群落多樣性的差異是否依土層不同而不同？還有待進(jìn)一步研究。另外，我國南亞熱帶地區(qū)氣候干濕季分明（4—9月為濕季，10月至翌年3月為干季），而不同季節(jié)會對植被土壤微生物群落多樣性產(chǎn)生影響[28,34-35]。因此，本文研究的5種人工林對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響是否會因季節(jié)而異，還需深入探究。

5 結(jié)論

南亞熱帶地區(qū)的馬尾松、紅錐、米老排、火力楠和尾巨桉等人工林在0～20 cm 土層間土壤細(xì)菌群落多樣性無顯著差異，5種人工林土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤全氮和全磷顯著正相關(guān)。說明鄉(xiāng)土闊葉樹種（紅錐、米老排和火力楠）人工林對表層土壤細(xì)菌群落多樣性的影響效果與鄉(xiāng)土針葉馬尾松人工林及外來尾巨桉人工林相似。因此，在該地區(qū)營建鄉(xiāng)土樹種人工林與外來按樹人工林對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響效果無明顯差異。