張成，王涵，許志強(qiáng)，朱丹萱，魏繼福

豚草原產(chǎn)于北美洲的沙漠地區(qū)，于20世紀(jì)30年代傳入中國，并在我國遼寧、新疆、北京、山東、上海、河北、江蘇、湖南、四川等20多個(gè)省市自治區(qū)發(fā)生[1-3]。豚草花粉是氣傳花粉，具有很強(qiáng)的致敏性[4],其中，三裂葉豚草是豚草花粉中變應(yīng)性較強(qiáng)的一種[5]，花粉顆粒較小，僅有18～20 μm，容易進(jìn)入上呼吸道，引起變態(tài)反應(yīng)，是秋季花粉癥的主要變應(yīng)原[6-8]。

目前，鈣結(jié)合蛋白(polcalcin)的致敏性在多個(gè)物種中均有報(bào)道，是花粉、甲殼類食物等的交叉過敏原[9-12]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)對三裂葉豚草花粉過敏原鈣結(jié)合蛋白Amb t polcalcin1進(jìn)行鑒定，并對Amb t polcalcin1基因進(jìn)行克隆、誘導(dǎo)表達(dá)，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)研究Amb t polcalcin1基因的致敏性，并進(jìn)行同源性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

三裂葉豚草花粉的轉(zhuǎn)錄組測序由北京奧維森基因科技有限公司完成，引物序列合成和克隆菌基因測序由南京擎科生物科技有限公司完成。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、T/A克隆試劑盒、DNA膠純化試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等購于寶生物工程(大連)有限公司(大連Takara公司)，重組克隆試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 過敏患者血清納入標(biāo)準(zhǔn)

每例患者抽取血清樣本4 mL，3 000 r/min離心5 min，采用Phadia1000熒光酶免疫檢測(ImmunoCAP)系統(tǒng)檢測患者血清中sIgE濃度。檢測范圍0.1 kUA/L和100 kUA/L，以0.35 kUA/L為閾值，sIgE結(jié)果≥0.35為陽性[13]。所有患者血清三裂葉豚草花粉的sIgE濃度均為陽性。

1.2.2 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1基因信息、擴(kuò)增和克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，使用BLAST序列比對工具，將測序得到的序列與數(shù)據(jù)庫(IUIS)報(bào)道的已知鈣結(jié)合蛋白序列進(jìn)行比較，得到一個(gè)潛在的鈣結(jié)合蛋白序列，并根據(jù)全長設(shè)計(jì)引物(圖1)，進(jìn)而進(jìn)行PCR擴(kuò)增、T/A克隆和重組克隆。

圖 1 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1核苷酸序列和氨基酸序列Fig 1 Nucleotide and amino acid sequence of Ambrosia trifida pollen Amb t polcalcin1

1.2.3 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1表達(dá)

重組克隆后，對重組菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，轉(zhuǎn)化到BL-21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，使用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(終濃度為1 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選成功表達(dá)的菌落進(jìn)行大規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法，將純化的三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1(濃度為10 μg/mL)于4°包被過夜，豚草花粉過敏患者的血清按照1∶10稀釋作為ELISA試驗(yàn)的一抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次后，加入anti-IgE孵育1 h，使用TMB進(jìn)行顯色。

1.2.5 免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)

采用免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)方法，將10 μg三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1上樣后進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，以ELISA結(jié)果陽性血清按照1∶10進(jìn)行稀釋作為一抗，使用anti-IgE作為二抗，化學(xué)發(fā)光顯影檢測。

1.2.6 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1保守性分析

根據(jù)鑒定出的三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1的氨基酸序列信息，利用ESPript3.0軟件與其他物種中的Amb t polcalcin1進(jìn)行多重序列比對，明確三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1中高度保守的氨基酸序列。

2 結(jié)果

2.1 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1基因擴(kuò)增和基因克隆

三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1 PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖電泳，得到大小約300 bp的片段(圖2)，對目的片段切膠回收后進(jìn)行TA克隆和重組克隆，并送公司測序。三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1序列編碼區(qū)共有249個(gè)堿基，編碼83個(gè)氨基酸(圖1)。其中，PCR前引物：F:AGGAAACAA TTATGGCAGAGGACG，后引物R:GAGAGGCATT ACCCAAACAATCAC；重組前引物F:CAGCAAAT GGGTCGCGGATCCATGGCAGAGGACGAAGAC，后引物R:GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGAATATCTTGCCAAC。

圖 2 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig 2 PCR amplification of Ambrosia trifida pollen Amb t polcalcin1M：DNA marker DL2000；1:三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1基因擴(kuò)增; bp:堿基對

2.2 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1誘導(dǎo)表達(dá)

提取重組菌質(zhì)粒，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE篩選成功表達(dá)的菌落，結(jié)果顯示，三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1蛋白形式在相對分子質(zhì)量10 000附近表達(dá)(圖3)。

圖 3 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)Fig 3 Expression of Ambrosia trifida pollen Amb t polcalcin1M：蛋白marker26616;A：未誘導(dǎo)菌;B：誘導(dǎo)菌;C：超聲裂解后誘導(dǎo)菌上清;D：超聲裂解后誘導(dǎo)菌沉淀(包涵體);E：純化蛋白，箭頭代表重組鈣結(jié)合蛋白Amb t polcalcin1; Mr:相對分子質(zhì)量

2.3 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1 ELISA分析

收集100份三裂葉豚草花粉過敏患者的血清，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。以11份陰性血清的吸光度值計(jì)算，其中cut-off用x+3s表示，結(jié)果為0.232 99，即圖中虛線位置。ELISA結(jié)果顯示，100份患者血清中14份血清的ELISA值高于cut-off值，陽性率為14%(圖4)。

圖 4 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1 ELISA

2.4 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1 Western blot

14份ELISA陽性血清進(jìn)行Western blot分析，用2份陰性血清作對照。結(jié)果顯示，編號13、22、30、62的4份血清含有IgE且能與三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1結(jié)合，顯示陽性條帶(圖5)。

圖 5 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1 Western blot結(jié)果

2.5 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1保守性分析

通過ESPript3.0軟件比對分析，三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1與赤楊、艾屬、豚草屬等序列具有較高的一致性(圖6)，其中，三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1與其近緣物種豚草屬花粉中兩個(gè)Amb t polcalcin1過敏原Amb a 9.0101和Amb a 9.0102的同源性最高，分別為95.18%和93.98%。與藜草Che a 3.0101、狗牙根Cyn d 7.0101、油橄欖Ole e 3.0101、紫丁香Syr v 3.0101的一致性分別為79.07%、75.90%、82.14%、80.72%。

圖 6 三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

豚草是一種世界性公害植物，雖然各個(gè)種類的豚草變應(yīng)原不一致，但具有一定的相似性，能夠激發(fā)交叉反應(yīng)[14-16]。豚草是一種非常重要的氣傳變應(yīng)原，研究發(fā)現(xiàn)，在對200例花粉過敏的患者進(jìn)行隨機(jī)抽樣實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有11%的人對豚草過敏，可導(dǎo)致哮喘和季節(jié)性過敏性鼻炎[17]。而在抗原皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢查中顯示，遼寧省沈陽市因豚草花粉過敏的患者有上萬人，其中氣傳致敏花粉主要以三裂葉豚草為主，其在花期能夠產(chǎn)生大量致敏性極強(qiáng)的花粉，導(dǎo)致易感人群出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)[18-19]。豚草花粉的主要致敏成分是蛋白質(zhì)，因此分離純化花粉中的致敏蛋白組分，明確其變應(yīng)原的特征具有十分重要的作用。

本研究采用ImmunoCAP系統(tǒng)檢測患者血清中sIgE濃度，以0.35 kUA/L為閾值，sIgE結(jié)果≥0.35為陽性。結(jié)果顯示，所有患者血清中三裂葉豚草花粉的sIgE濃度均為陽性，以此鑒定出血清中抗體為IgE。之后，對三裂葉豚草花粉新型過敏原鈣結(jié)合蛋白Amb t polcalcin1及其致敏性進(jìn)行分析。通過多重比對分析發(fā)現(xiàn)，三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1與其近緣性物種豚草花粉中已經(jīng)報(bào)道的兩種Amb t polcalcin1過敏原具有非常高的保守性，氨基酸序列的一致性分別為95.18%和93.98%，與其他物種的Amb t polcalcin1過敏原的氨基酸序列一致性比例也在70%以上。在對患者血清中sIgE濃度檢測時(shí)，ImmunoCAP系統(tǒng)是針對矮豚草進(jìn)行檢測，基于血清sIgE結(jié)果開展ELISA活性試驗(yàn)，本研究中鑒定的三裂葉豚草花粉過敏原，使用該血清獲得ELISA陽性結(jié)果也是交叉反應(yīng)的結(jié)果，與進(jìn)化樹分析序列的保守性和同源性結(jié)果一致。進(jìn)一步對三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1的免疫活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其致敏率為14%，這與已經(jīng)報(bào)道的其他物種polcalcin的致敏率[20-21]相似。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)三裂葉豚草花粉新型過敏原鈣結(jié)合蛋白Amb t polcalcin1與其他多種物種中的Amb t polcalcin1過敏原具有較高的同源性。三裂葉豚草花粉新型過敏原鈣結(jié)合蛋白Amb t polcalcin1在豚草花粉過敏患者的致敏率為14%，與其他物種Amb t polcalcin1致敏率類似。以上結(jié)果進(jìn)一步完善了三裂葉豚草花粉Amb t polcalcin1的致敏原信息，為低致敏疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。