阿地拉·阿不都拉，蒲云峰，2，黨艷青

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾843300；3.塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

0 引言

蘋果為薔薇科（Rosacea）蘋果屬（Malus Mill）多年生木本植物，是我國栽培面積最大、產(chǎn)量最高的果樹之一[1]。根據(jù)2020年《中國統(tǒng)計年鑒》和《中國農(nóng)村統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)，截至2019年，我國蘋果總產(chǎn)量為4 242.5萬t，其中陜西、山東、山西、河南、甘肅、遼寧、河北和新疆蘋果產(chǎn)量分別占我國蘋果總產(chǎn)量的26.8%，22.4%，9.9%，9.6%，8.0%，5.8%，5.2%，4.0%。新疆蘋果產(chǎn)量全國排名第八，晝夜溫差大，光照充足，非常適宜蘋果生長，形成了“阿克蘇冰糖心”蘋果這一特色品牌。蘋果已成為新疆林果業(yè)發(fā)展的主要樹種之一，近年來其栽培面積和產(chǎn)量均保持以5%以上增長速率。

糖是蘋果重要風(fēng)味成分和營養(yǎng)成分，其種類和含量是評價蘋果品質(zhì)的重要指標，準確測定蘋果中糖的含量對于研究蘋果的品質(zhì)和貯藏加工具有重要的意義[2]。水果中可溶性糖分的測定方法有化學(xué)分析法、分光光度法、氣色相色譜法、高效毛細管電泳法和高效液相色譜法等[3]，其中HPLC法因其具有快速、簡便、準確等優(yōu)點，常用于食品中糖類的檢測[4]。目前，已有大量文獻報道蘋果及其他水果中可溶性糖的測定，如熊仁次等人[5]分析了蘋果中可溶性糖，發(fā)現(xiàn)糖心部位山梨醇含量是非糖心部位的1.4倍。蒲小秋等人[3]采用HPLC-ELSD法測定鮮棗果實中可溶性糖，發(fā)現(xiàn)棗果中主要含有果糖、葡萄糖和蔗糖。然而，近年來文獻對樣品處理的溶劑選擇不夠嚴謹，熊仁次等人[5]和蒲小秋等人[3]處理樣品時溶劑為80%乙醇[6]或70%乙醇[7]，樣品處理程序繁雜，并且水果中可溶性糖（果糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖）為水溶性物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，以水為溶劑更為合理。也有大量文獻中報道以水為溶劑[8-10]，那么樣品處理時，應(yīng)該選擇以水還是乙醇為溶劑呢？GB/T 5009.7—2016、GB/T 5009.8—2016和GB/T 5513—2019中均以水作為溶劑，而GB/T 37493—2019中以80%乙醇為溶劑，似乎用水和80%乙醇作為溶劑都可以，但從這些國標的適用范圍來看，GB/T 5009.7—2016、GB/T 5009.8—2016和GB/T 5513—2019適用于谷物類、乳制品、果蔬制品、蜂蜜、糖漿、飲料等食品中可溶性糖的測定，而GB/T 37493—2019適用于谷物和豆類。在傳統(tǒng)的樣品處理中，水提會使樣品中淀粉和糊精類物質(zhì)溶出，影響測定，同時過濾也困難，用一定體積分數(shù)的乙醇浸提能夠解決這一問題。此外，針對富含水溶性蛋白的谷物和豆類樣品，以乙醇為溶劑，可以免去除蛋白的預(yù)處理步驟。綜合來看，測定蘋果中游離糖時，應(yīng)該選擇水為溶劑。

因此，旨在對蘋果可溶性糖HPLC-RID法的樣品處理進行簡化，獲得一種簡單、可靠的蘋果樣品處理方法，并分析阿克蘇“冰糖心”蘋果的糖心和非糖心部位及全果中果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的含量，為了解阿克蘇“冰糖心”蘋果的品質(zhì)特征提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“冰糖心”蘋果，2020年10月下旬采摘于阿克蘇地區(qū)紅旗坡果園。

果糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇均為色譜純標準試劑，上海阿拉丁生化科技館股份有限公司提供；乙腈（色譜純），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司提供。

1.2 試驗儀器

TGL-20M型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；LC-20A型液相色譜、RID20A型檢測器。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

選取果形大小、色澤基本一致，無明顯損傷的“冰糖心”蘋果15個，取其中10個蘋果沿果實中間部位分別橫切和縱切成4塊，分別挖去糖心部分和非糖心部位；剩余5個“冰糖心”蘋果去皮和果核部位后獲得“冰糖心”蘋果樣品。將獲得的樣品用組織勻漿機勻漿后，置于-20℃下貯藏備用。

稱取一定量的果肉，加蒸餾水攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容，靜置過夜后，超聲處理30 min，然后以轉(zhuǎn)速9 000 r/min離心15 min，去上清液過0.22 μm針式濾膜，置于4℃下備用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱Platisil NH2（250 mm×4.6 mm，i.d.）柱（天津迪馬），柱溫30℃，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，流動相乙腈∶水=70∶30（V/V）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以x±SD表示，采用SPSS20.0進行方差分析，并進行Duncan's多重比較（p<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖標準品和蘋果樣品的色譜圖

糖標準品和蘋果樣品的HPLC圖見圖1。

圖1 糖標準品和蘋果樣品的HPLC圖

由圖1可以看出，混合糖標的HLC色譜圖中果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的保留時間分別為10.30，11.28，11.83，15.33 min，除山梨醇和葡萄糖的色譜峰有少量重疊外，其余色譜峰之間均能明顯區(qū)分。在蘋果樣品中，也主要存在果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖游離糖，這與文獻報道一致[11-12]。

2.2 取樣量對峰面積的影響

分別稱取1，5，10，15，20 g蘋果果肉各5份，參照1.3.1的方法進行樣品制備，然后進樣分析。

取樣量對峰面積的影響見表1。

由表1中的RSD來看，取樣量對蘋果中山梨醇、葡萄糖和蔗糖峰面積的RSD影響較大而果糖峰面積的RSD相對穩(wěn)定。除果糖外，隨著取樣量的增加，色譜峰的RSD呈減小趨勢，由于取樣量過大，會增加樣品處理難度。因此，采用HPLC-RID法分析蘋果中糖的含量時，取樣量以10～15 g為宜。

表1 取樣量對峰面積的影響

2.3 穩(wěn)定性

稱取15 g蘋果果肉，參照1.3.1的方法進行樣品制備，離心后取上清液過0.22 μm針式濾膜，準備5份相同的樣品，分別在4℃的條件下放置0，0.5，1，3，5 d后進樣，每個樣品重復(fù)3次，并計算其平均值。

穩(wěn)定性試驗見表2。

由表2可以看出，各個糖的相對標準誤差（RSD）<5%，說明該分析條件下，樣品的穩(wěn)定性較好，即在4℃的條件下放置5 d內(nèi)，樣品測定結(jié)果穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗

2.4 回收率

稱取15 g蘋果果肉5份，每份分別添加果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖標準品1.10，0.30，0.40，0.50 g，參照1.3.1的方法進行樣品制備，然后進樣分析，根據(jù)峰面積計算。

回收率試驗見表3。

表3 回收率試驗

由表3可以看出，各個糖的回收率為93.59%～99.76%，回收率均超過90%，說明該方法分析蘋果中糖含量的回收率較好。

2.5 標準曲線

稱取一定量的標準品配制成不同質(zhì)量濃度的標準品溶液，然后參照1.3.2的色譜條件分析，以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，果糖、山梨醇、葡萄糖和蔗糖的標準曲線、相關(guān)系數(shù)（R2）和線性范圍。以質(zhì)量濃度最小的標準溶液逐級稀釋，然后進樣分析，通過信噪比的計算獲得檢測限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）。

標準曲線見表4。

表4 標準曲線

由表4可以看出，各個糖的標準曲線的相關(guān)系數(shù)（R2）均為0.999 9，表明在0.5～30 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好。從檢測限（LOD）和定量限（LOQ）來看，該方法的靈敏度也較好，能夠滿足蘋果樣品中游離糖含量的測定，但該方法的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）遠高于一些文獻報道[3，7]，主要原因是他們采用的檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），其靈敏度遠遠高于示差檢測器（RID），這也說明對于游離糖含量較低的樣品分析時，選擇蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）較好。

2.6 蘋果樣品中游離糖的測定

稱取一定量的蘋果樣品，參照1.3.1的方法樣品制備，然后參照1.3.2的方法進樣分析，每個處理重復(fù)3次，以峰面積計算樣品中游離糖含量。

蘋果中游離糖含量見表5。

由表5可以看出，果糖是蘋果中含量最高的游離糖，約占總游離糖的50%；其次是蔗糖，含量約占總游離糖含量20%；而葡萄糖和山梨醇的含量較低。全果與非糖心果肉中游離糖無顯著差異（p>0.05），然而糖心果肉的總游離糖、果糖、蔗糖和葡萄糖均顯著低于全果和非糖心果肉（p<0.05），山梨醇顯著高于全果和非糖心的果肉（p<0.05）。Aprea E等人[13]分析了40個蘋果樣品（來源于17個品種），發(fā)現(xiàn)蘋果汁中總游離糖的含量為74.7～142.9 mg/g，此次分析的結(jié)果接近其上限，可能是由于阿克蘇地區(qū)光照充足、晝夜溫差大，有利于蘋果中糖類物質(zhì)的積累。此外，阿克蘇“冰糖心”蘋果的山梨醇含量為16.53±0.03 mg/g，遠遠高于其他地區(qū)蘋果中山梨醇的含量[14]。有文獻報道，山梨醇不僅為植物生長發(fā)育提供能量和碳骨架，而且它也作為信號分子參與調(diào)節(jié)植物生長、發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)[15]，阿克蘇地區(qū)10月份夜間溫度常在-5℃以下[16]，說明阿克蘇紅富士蘋果在成熟過程中受到冷脅迫，引起山梨醇的積累，說明山梨醇與阿克蘇蘋果的“冰糖心”形成密切相關(guān)。

表5 蘋果中游離糖含量 /mg·g-1

3 結(jié)論

優(yōu)化了蘋果中游離糖測定樣品處理方法，取10～15 g勻漿后的果肉，用蒸餾水攪拌均勻后，定容至100 mL，室溫超聲30 min，能夠充分提取出果肉中游離糖。然后，建立了HPLC-RID法測定蘋果中果糖、山梨醇、葡糖糖和蔗糖的方法，該方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好、簡便、快速等優(yōu)點，為蘋果和其他果品中游離糖提供準確、可靠的分析方法。此外，通過分析阿克蘇“冰糖心”蘋果的游離糖組成，發(fā)現(xiàn)阿克蘇“冰糖心”蘋果中游離糖含量較高外，其山梨醇含量也很高，可能是因低溫脅迫引起山梨醇積累。在今后研究中，山梨醇應(yīng)作為阿克蘇“冰糖心”蘋果的一個重要品質(zhì)特征指標。