耿彥梅，高 晗，李雪利，田 方，孫福仁，曾永禎，李軍山,2

(1.神威藥業(yè)集團有限公司，河北石家莊 051430；2.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司，云南楚雄675000)

枳實為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥幼果，于5—6月收集自落的果實，除去雜質(zhì)，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥(較小者直接曬干或低溫干燥)而成。枳實為常用中藥，其性苦、辛、酸、溫，歸脾、胃經(jīng)，能夠破氣消積、化痰散痞，用于治療積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、大便不通、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等癥[1]。

枳實主要成分為黃酮、生物堿、揮發(fā)油等，其具體成分隨原植物、部位而異。酸橙果實含橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin)、柚皮苷(naringin)、辛弗林(synephrine)、N-甲基酪胺(N-thyltyramine)等；未成熟果皮含柚皮苷、野漆樹苷(rhoifolin)、忍冬苷(lonicerin)、新橙皮苷等；在果實成熟時新橙皮苷消失[2-6]。

枳實具有廣泛的藥理作用，如維生素P樣作用、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗?jié)?、抑制毛細血管脆性等；對心血管系統(tǒng)、胃腸平滑肌、子宮、泌尿系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)等均有一定的藥理作用[7-10]。

日本于20世紀60年代開始“漢方藥”顆粒研究，80年代納入國民健康保險范圍；韓國20世紀90年代初開始生產(chǎn)中藥顆粒；在新加坡等國，配方顆粒已基本取代中藥飲片。中國配方顆粒發(fā)展正在逐步規(guī)范化，2019年11月，國家藥監(jiān)局綜合司公開征求《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求(征求意見稿)》意見，這對促進中藥配方顆粒標準統(tǒng)一、規(guī)范中藥配方顆粒生產(chǎn)、推進中醫(yī)藥現(xiàn)代化進程具有重要意義。隨著中藥配方顆粒研究的日益深入，中藥配方顆粒必將成為中藥發(fā)展的重要組成部分。

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，在中醫(yī)理論指導下，按照中醫(yī)臨床處方調(diào)配，供患者沖服使用，其臨床效應(yīng)應(yīng)當和相應(yīng)飲片保持一致。中藥飲片是中醫(yī)藥發(fā)揮臨床療效的重要藥用物質(zhì)，其安全性、有效性已得到廣泛認可。為使中藥配方顆粒能夠承載中藥飲片的安全性、有效性，需要以標準湯劑為橋接，該標準湯劑為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準[11]。

截至目前，對枳實飲片的化學成分及特征圖譜的研究已經(jīng)比較透徹，但對枳實標準湯劑的研究寥寥無幾[12-15]。筆者選擇了15批不同產(chǎn)地枳實飲片制成的標準湯劑，建立了枳實標準湯劑中辛弗林含量、特征圖譜測定方法，對它們的制備、出膏率、主成分含量及含量轉(zhuǎn)移率、特征圖譜等進行研究，以期為枳實配方顆粒的質(zhì)量標準研究提供基礎(chǔ)依據(jù)，同時為批量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定枳實配方顆粒提供產(chǎn)地參考。

1 主要儀器與材料

1.1 儀 器

LC-20A型高效液相色譜儀，InertSustain AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)(日本島津公司提供)；分析天平(0.000 01 g，德國賽多利斯公司提供)；JM-A5002電子天平(0.01 g，余姚市紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司提供)；水循環(huán)真空泵(上海申生科技有限公司提供)；DHG-9140A熱風循環(huán)鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司、太倉精宏儀器設(shè)備有限公司提供)；KH3200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供)。

1.2 試 劑

辛弗林對照品，批號為110727-201809，純度為99.5%；橙皮苷對照品，批號為110721-201818，純度為96.2%；新橙皮苷對照品，批號為111857-201804，純度為99.4%，均由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙醇，均為分析純，由天津市科密歐化學試劑有限公司提供；水為自制純化水；磷酸為HPLC級，由美國ACS恩科化學公司提供。

1.3 飲 片

15批枳實飲片經(jīng)原河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥幼果。樣品詳細信息見表1。

表1 枳實飲片產(chǎn)地批號信息Tab.1 Origin and batch number information of Aurantii Fructus Immaturus decoction pieces

2 實驗部分

2.1 標準湯劑的制備

2.1.1 制備方法

1)煎煮 取枳實飲片50 g于煎藥壺中，第1次加飲片量8倍飲用水，浸泡30 min，加熱煎煮30 min，藥液趁熱過300目(48 μm，下同)濾布，第2次加飲片量6倍飲用水，煎煮20 min，藥液趁熱過300目濾布，合并2次煎液。

2)濃縮 將提取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中低溫(65 ℃)濃縮至生藥量與藥液體積比為1∶3。

3)干燥 采用冷凍干燥，將濃縮液搖勻倒入不銹鋼盤中(注意確保盤內(nèi)濃縮液薄厚一致，一般不超過0.5 mm)，放于冷凍干燥機內(nèi)，進行干燥，即得枳實標準湯劑。

2.1.2 制備工藝驗證

取枳實飲片(批號20010816)6份，每份50 g，按照2.1.1進行標準湯劑制備，測定出膏率及辛弗林含量，驗證信息見表2。

表2 工藝驗證信息Tab.2 Information of process validation

由表2可看出，6批飲片出膏率及辛弗林含量RSD均小于10%，說明此工藝穩(wěn)定。

2.1.3 15批枳實標準湯劑的制備

分別取15批不同產(chǎn)地、不同批號的枳實飲片按2.1.1項下的制備方法進行制備，即得15批枳實標準湯劑。

2.2 辛弗林的色譜分析

實驗選用InertSustain AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)，流動相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液(體積比為50∶50，取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1 000 mL)等度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為225 nm，柱溫為28 ℃，進樣量為10 μL，進行色譜分析。

2.2.1 對照品溶液的制備

取辛弗林對照品適量，精密稱定。加純化水制成每1 mL含30 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

2.2.2 供試品溶液的制備

取枳實標準湯劑膏粉適量，研細，取約0.2 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用95%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.3 方法學考察

1)專屬性考察

使用空白溶劑作為陰性對照，通過對照品溶液指認枳實標準湯劑樣品中辛弗林峰(參照峰)，進行專屬性試驗，見圖1。在辛弗林出峰位置處，陰性樣品未見有明顯干擾，說明本方法的專屬性良好。

圖1 枳實標準湯劑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

2)線性考察

精密稱定辛弗林對照品7.52 mg，置250 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，備用。分別吸取上述儲備液1，2，4，6，8，10 mL于20 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，備用。分別吸取以上各對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以辛弗林含量為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線(見圖2)，回歸方程為y=453x+317.2，R=0.999 99，表明辛弗林在0.015 0～0.150 4 mg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 辛弗林的線性關(guān)系考察Fig.2 Linear investigation of Synephrine

3)準確度考察

精密稱取枳實標準湯劑(批號為20010816，質(zhì)量分數(shù)為11.33 mg/g)6份，每份約0.1 g，精密加入一定量的辛弗林對照品溶液，按上述供試品溶液制備方法制備，精密吸取供試品溶液10 μL，以上述色譜條件測定，結(jié)果辛弗林的平均回收率為100.20%(n=6)。

4)精密度考察

取枳實膏粉按2.2.2項下制備方法制備供試品1份，重復測定6次，得到枳實標準湯劑中辛弗林的平均含量為2.42 mg/g(質(zhì)量分數(shù)，下同)，RSD為0.63%，表明儀器符合精密度要求。

5)重復性考察

取枳實膏粉按2.2.2項下制備方法平行制備供試樣品6份，測定枳實標準湯劑中辛弗林的平均含量，結(jié)果為2.43 mg/g，RSD為1.26%，符合2015年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定(≤1.5%)。

6)穩(wěn)定性考察

取2.2.2項下供試品分別在0，3，6，9，12 h測定辛弗林的含量，枳實標準湯劑膏粉供試品在12 h內(nèi)的辛弗林平均含量為2.40 mg/g，RSD為1.21%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 特征圖譜的測定

實驗選用InertSustain AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)，流動相為甲醇(A)-磷酸二氫鉀溶液(B)(取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1 000 mL)梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為225 nm，柱溫為28 ℃，進樣量為10 μL，測定特征圖譜。梯度洗脫程序詳見表3。

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Gradient elution procedure

2.3.1 對照品溶液制備

取辛弗林對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含30 μg的溶液，即得；取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得；取新橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷和新橙皮苷80 μg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備

同2.2.2。

2.3.3 方法學考察

1)精密度考察

取枳實膏粉按2.2.2項下制備方法制備供試品1份，重復測定6次，6次測定枳實標準湯劑中各峰的RSD均小于1.0%，說明此方法精密度良好，儀器符合精密度要求。

2)重復性考察

取枳實膏粉按2.2.2項下制備方法平行制備供試樣品6份，6次測定枳實標準湯劑中各峰的RSD均小于1.0%，說明此方法重復性良好，符合2015年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定(≤1.5%)。

3)穩(wěn)定性考察

取2.2.2項下供試品分別在0，3，6，9，12 h測定特征圖譜，結(jié)果顯示，在12 h內(nèi)各峰的RSD均小于1.0%，表明供試品在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

3 結(jié)果及分析

3.1 15批枳實標準湯劑辛弗林含量測定

取15批枳實標準湯劑膏粉，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件測定。結(jié)果如表4所示。

表4 15批標準湯劑中辛弗林含量及含量轉(zhuǎn)移率(n=2)Tab.4 Synephrine content and content transfer rate in 15 batches of standard decoction(n=2)

3.2 辛弗林含量及含量轉(zhuǎn)移率結(jié)果分析

15批枳實標準湯劑出膏率均值為15.14%，RSD為19.31%，表明不同產(chǎn)地枳實的出膏率差異較大，范圍為10.50%～19.91%；辛弗林含量均值為9.07 mg/g，RSD為33.05%，表明不同產(chǎn)地枳實的辛弗林含量差異較大，范圍為5.92～15.21 mg/g；辛弗林含量的轉(zhuǎn)移率均值為22.65%，RSD為45.92%，表明不同產(chǎn)地枳實間的辛弗林含量轉(zhuǎn)移率差異較大，范圍為10.24%～47.70%，辛弗林含量轉(zhuǎn)移率差異較大主要是因為不同產(chǎn)地枳實的出膏率及含量差異較大引起的。

綜合出膏率、辛弗林含量及含量轉(zhuǎn)移率，可知湖南的永州、常德，江西的井岡山、景德鎮(zhèn)等地的枳實質(zhì)量較佳。

3.3 15批枳實標準湯劑特征圖譜測定

取15批枳實標準湯劑膏粉，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件進行測定，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 枳實標準湯劑HPLC對照圖譜Fig.3 HPLC control of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

圖4 15批枳實標準湯劑HPLC圖譜Fig.4 HPLC spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

3.4 特征圖譜結(jié)果分析

比對15批枳實標準湯劑膏粉特征圖譜，共得到7個共有峰，其相對峰面積見表5，可以看出峰面積的RSD差異較大，表明不同產(chǎn)地、不同批次枳實間的化學成分含量存在較大差異；而相對保留時間(見表6)的RSD都比較小，表明出峰時間比較穩(wěn)定；特征圖譜相似度的比對結(jié)果見表7。與對照譜圖比對，相似度為0.655～0.936，總體來說不同產(chǎn)地、不同批次間枳實標準湯劑膏粉的特征圖譜與對照特征圖譜相似度欠佳，表明枳實標準湯劑各產(chǎn)地、各批次間的化學成分種類及含量差異較大。

表5 15批枳實標準湯劑特征圖譜相對峰面積Tab.5 Relative peak areas of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

表6 15批枳實標準湯劑特征圖譜相對保留時間Tab.6 Relative retention time of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

表7 15批枳實標準湯劑特征圖譜相似度Tab.7 Similarities of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

4 結(jié) 語

本研究通過選取具有代表性的15批不同產(chǎn)地的枳實飲片制成的標準湯劑，建立了枳實標準湯劑中辛弗林含量、特征圖譜的測定方法，此方法已通過方法學驗證，具有較高的穩(wěn)定性，可用于枳實標準湯劑的質(zhì)量研究。

15批枳實標準湯劑出膏率均值為15.14%，范圍為10.50%～19.91%；辛弗林含量均值為9.07 mg/g，范圍為5.92～15.21 mg/g；辛弗林含量的轉(zhuǎn)移率均值為22.65%，范圍為10.24%～47.70%。綜合出膏率、辛弗林含量及含量轉(zhuǎn)移率，可知湖南永州、常德，江西井岡山、景德鎮(zhèn)等地的枳實質(zhì)量較佳。

本次研究選取4個產(chǎn)地的枳實藥材為研究對象，其中江西為道地產(chǎn)區(qū)，其余產(chǎn)地為主產(chǎn)區(qū)。標準湯劑研究發(fā)現(xiàn)，枳實標準湯劑含量、含量轉(zhuǎn)移率的RSD分別為33.05%，45.92%，表明不同產(chǎn)地間枳實中的辛弗林含量差異較大，需要收集更多批次樣品進行研究，以確保枳實標準湯劑更具代表性、適用性。今后將會收集更多主產(chǎn)區(qū)不同批次的樣品，進一步補充完善枳實標準湯劑的相關(guān)數(shù)據(jù)。