劉麗燕(陽江市檢測檢驗中心，廣東 陽江 529500)

0 引言

人血白蛋白是一種蛋白，它并不是人體自身產(chǎn)生的，而是從人的血清中制備而得到的，人血白蛋白的功效非常大，它能夠調(diào)節(jié)人體血液的膠體滲透壓，從而使人體機制恢復(fù)正常。人血白蛋白由健康人血漿經(jīng)過低溫乙醇工藝分離純化，并經(jīng)過60 ℃ 10 h加熱滅活病毒后得到的血液制品。臨床上，主要用于失血性創(chuàng)傷以及燒傷引起休克、腦水腫以及顱內(nèi)損傷引起的顱內(nèi)壓升高、肝硬化以及腎病引起的腹水、低蛋白血癥的防治、新生兒高膽紅素血癥、心肺復(fù)蘇術(shù)以及燒傷的輔助治療，血液透析的輔助治療以及呼吸窘迫綜合征的治療[1]?，F(xiàn)最權(quán)威的人血白蛋白含量是按照《中國藥典》四部通則進(jìn)行測定，其中有凱氏定氮法、福林酚法 、雙縮脲法、2,2'-聯(lián)喹啉-4, 4’二羧酸法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外 -可見分光光度法，本次使用凱氏定氮法進(jìn)行人血白蛋白含量測定，但具體的人血白蛋白凱氏定氮儀的測量參數(shù)還需要繼續(xù)去探索，經(jīng)過一系列條件檢測，探索了以下最佳的人血白蛋白含量測定的儀器檢測方法。本次實驗進(jìn)一步熟悉了蛋白質(zhì)的含量測定和實驗室能力驗證的要求[2-4]，同時也提高了能力驗證結(jié)果的滿意水平[5-6]。

1 檢測條件

1.1 儀器

(1)凱氏定氮儀K-360；(2)消解儀K436；(3)AB204-N型電子天平

1.2 試劑

氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅、硫酸、硫酸鉀試劑均采用分析純；

水采用廣州屈臣氏食品飲料有限公司的飲用水。

1.3 蛋白質(zhì)檢測方法設(shè)置

滴定類型：硼酸 蒸餾攪拌速度：5 s

滴定攪拌速度：7 s 反應(yīng)時間：10 s

蒸汽力度：80% 蒸餾時間：480 s

開始滴定：480 s 水：50 mL

40%氫氧化鈉：10 mL 2%硼酸：10 mL

2 供試品的制備

精密量取1.55 mL人血白蛋白[10 g/瓶(20% 50 mL)],至50 mL容量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置消解管內(nèi)，加硫酸鉀0.3 g與30%硫酸銅溶液5滴，再沿瓶壁滴加硫酸2.0 mL，放入消解儀，安裝完善，消解儀調(diào)到3檔180 ℃消解5 min(去除水分)，調(diào)到6檔350 ℃消解5 min(接近硫酸沸點)，調(diào)到7檔410 ℃消解60 min，至溶液變成澄明的綠色，再繼續(xù)消解10 min，取出，冷卻。

3 實驗操作步驟

按照說明書的要求將已冷卻的消解管裝入凱氏定氮儀的正確位置，關(guān)上安全門，連接水源。按照1.2的檢測方法設(shè)置蛋白質(zhì)含量測定的方法，其中水50 mL,氫氧化鈉10 mL,硼酸10 mL。將配制好的40%的氫氧化鈉，2%的硼酸和純化水分別置自動蒸餾儀相應(yīng)的大瓶中，用F=1.001的0.005 mol/L的硫酸滴定液自行自動滴定，記錄數(shù)據(jù)。

4 含量測定檢測結(jié)果及分析

4.1 滴定結(jié)果

滴定結(jié)果如表1所示。

表1 滴定結(jié)果 單位：mL

4.2 計算公式

蛋白質(zhì)含量%=[F×T×(V終-V空)×V稀×6.25]/(W取×M標(biāo)) ×100% (1)

式中：

F為滴定液的濃度值與其名義值之比，F(xiàn)=1.001；

T為 滴定度，T=0.140 1 mg/mL； V終為樣品滴定體積；

V空為空白滴定體積；

V稀為樣品稀釋的體積，稀釋體積=50 mL；

W取為樣品取樣量，取樣量=1.55 mL；

M標(biāo)為標(biāo)示量，標(biāo)示量=10 g/50 mL×1 000=200 mg/mL。

4.3 計算結(jié)果

計算結(jié)果如表2所示。

表2 計算結(jié)果

4.4 含量判定標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果分析

根據(jù)《中國藥典》2015年版人血白蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定：應(yīng)為標(biāo)示量的95.0%～110.0%；綜上所述，該人血白蛋白的含量在規(guī)定的范圍內(nèi)，是合格產(chǎn)品，該儀器檢測方法適用于人血白蛋白的含量測定。

5 方法學(xué)驗證

5.1 重復(fù)性試驗

取同一供試品，供試品溶液制備方法按照《2015版中國藥典》四部 通則0704制備6份供試品。按照正文含量測定方法，測定每份樣品中蛋白質(zhì)含量的滴定量，結(jié)果 RSD= 0.40%(n=6)，表明重復(fù)性良好(如表3所示)。

表3 測定樣品中蛋白質(zhì)含量的滴定量

6 討論

6.1 氫氧化鈉的影響

40%氫氧化鈉的作用是中和硫酸，變成堿性條件，加熱使氨氣游離出來，硼酸吸收。配制注意事項是及時攪拌，在通風(fēng)櫥內(nèi)配制，放涼后使用。若攪拌不及時容易結(jié)晶，那么溶液濃度容易達(dá)不到要求，所測結(jié)果會偏低。若很熱使用，反應(yīng)過于劇烈。另外氫氧化鈉不純的話，會導(dǎo)致空白數(shù)值不穩(wěn)定，影響檢測的準(zhǔn)確性。同時，NaOH加的都是偏過量的，濃度偏差不大的情況下，對結(jié)果沒有什么影響。

6.2 硼酸的影響

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消解，使蛋白質(zhì)分解，其中碳、氫被氧化為CO2和H2O逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨，硫酸銨用NaOH中和生成NH3·H2O，加熱又分解為氨，用硼酸吸收，吸收氨后的硼酸生成硼酸氨再以標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量計算蛋白質(zhì)的含量。所以硼酸應(yīng)過量使用，使產(chǎn)生的氨可以充分被吸收，確保滴定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

6.3 硫酸銅、硫酸鉀與硫酸的影響

硫酸銅在整個消解反應(yīng)中起到催化劑的作用，使蛋白質(zhì)被分解；而硫酸則與被轉(zhuǎn)化為的氨結(jié)合為硫酸銨，繼續(xù)進(jìn)行下一步的反應(yīng)；硫酸鉀就起到提高硫酸沸點的作用。

6.4 消解溫度和時間的影響

整個消解過程需要有一個升溫的過程，一下子升溫太高，固體樣品容易碳化導(dǎo)致實驗失敗，只有開始消解時，由小的消解溫度到恒定，消解管整體才能受熱均勻，一般泡沫不會溢出管外。同時初始消解時溫度不可過低，過低造成消解時間延長。實驗證明初始消解溫度180 ℃為宜，只要消解管內(nèi)無泡沫產(chǎn)生，并按照上述時間升溫程序把溫度提高到410 ℃左右，就可加快消解速度。

7 結(jié)語

根據(jù)上述的討論進(jìn)行思考，設(shè)計硼酸、氫氧化鈉的加入量不同，探討稀硫酸的滴定量，最終得出加入40%氫氧化鈉10 mL，2%硼酸10 mL最為合適。同時，經(jīng)過與消解儀工程師的溝通和經(jīng)驗得出消解儀調(diào)到3檔180 ℃消解5 min(去除水分)，調(diào)到6檔350 ℃消解5 min(接近硫酸沸點)，調(diào)到7檔410 ℃消解60 min，至溶液變成澄明的綠色，再繼續(xù)消解10 min，取出，冷卻，這樣的消解程序最為適合人血白蛋白的消解。經(jīng)過方法學(xué)驗證中的重復(fù)性RSD=0.40%(n=6)，表明重復(fù)性良好，該檢測方法條件良好，適用人血白蛋白含量測定的檢測。