鄭亞斐 朱海艷 王維 胡晶晶 包天平 田兆方

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院新生兒科/淮安市小兒呼吸診療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇淮安 223300）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產(chǎn)兒常見(jiàn)的慢性肺部疾病，由肺損傷和未成熟肺的修復(fù)之間的不平衡引起［1］。此外，BPD還會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和其他系統(tǒng)器官造成損害［2］。由于目前BPD 缺乏有效的治療方法，因而針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究以便實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療一直是新生兒學(xué)的熱點(diǎn)話題。

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1（low-density lipoprotein receptor-related protein 1，LRP1） 是本課題組在前期臨床試驗(yàn)中通過(guò)數(shù)據(jù)非依賴采集質(zhì)譜技術(shù)，從BPD 患兒與非BPD 患兒的血漿中篩選并得到驗(yàn)證的差異表達(dá)蛋白［3］。這提示LRP1可能涉及BPD 發(fā)病機(jī)制。LRP1 是一種普遍存在的I型跨膜受體，可介導(dǎo)多種途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，涉及蛋白酶降解、炎癥調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞存活和遷移等［4］；還可結(jié)合內(nèi)吞40 多種結(jié)構(gòu)和功能不同的配體，包括載脂蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制復(fù)合物和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和尿激酶型纖溶酶原激活物［5］。MMPs是一種鋅依賴的蛋白水解酶，具有消化細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的能力，在生理和病理?xiàng)l件下都在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用［6］。MMPs不僅參與炎癥和致癌過(guò)程的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)，還參與胚胎發(fā)育和器官成熟（包括肺）［7］，其在BPD進(jìn)展中具有的作用已得到公認(rèn)［8-9］，近年來(lái)MMP9 在BPD的作用受到重視［10-11］。酪氨酸激酶2（prolinerich tyrosine kinase 2，Pyk2）是一種富含脯氨酸的非受體酪氨酸激酶，可由細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高而激活，還可被多種其他信號(hào)激活，如毒蕈堿型乙酰膽堿受體M1、蛋白激酶C、生長(zhǎng)因子、活性氧等［12］，pPyk2是其磷酸化形式。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道在血管平滑肌細(xì)胞［13］和成纖維細(xì)胞［14］中存在LRP1-pPyk2-MMP9信號(hào)通路。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pPyk2 與 LRP1β 鏈發(fā)生作用，且 pPyk2 和 MMP9 的特異性熒光在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的血管細(xì)胞中重疊［13］。另外，共聚焦顯微鏡圖像顯示，pPyk2、MMP9 和LRP1 共定位于心肌梗死后的心肌成纖維細(xì)胞中［14］。但目前尚未有 LRP1-pPyk2-MMP9 通路參與BPD 發(fā)病的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究旨在通過(guò)高氧誘導(dǎo)新生大鼠BPD 模型研究LRP1-pPyk2-MMP9信號(hào)通路的變化，為BPD的發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組

Sprague-Dawley 大鼠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。將出生時(shí)間相差半小時(shí)以內(nèi)的新生大鼠16只，雌雄不限，體重6～8 g，隨機(jī)分配至空氣對(duì)照組（吸入氧濃度=21%，空氣組）、高氧模型組（吸入氧濃度＞95%，高氧組），每組8 只。本實(shí)驗(yàn)取得南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。高氧組新生大鼠按本實(shí)驗(yàn)室方法于生后即置于＞95%氧濃度環(huán)境中持續(xù)暴露7 d 建立高氧肺損傷模型［15］，空氣組僅暴露于同室空氣環(huán)境中，適時(shí)補(bǔ)充飼料和水，更換墊料?？諝獗┞逗透哐醣┞兜哪甘竺?4 h 互換，以免母鼠因氧中毒影響新生鼠的哺乳喂養(yǎng)，交換母鼠過(guò)程輕拿輕放，防止母鼠激惹發(fā)生食子現(xiàn)象，記錄大鼠生長(zhǎng)情況。

1.2 標(biāo)本收集

兩組大鼠均于生后第8天稱重后腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，采用心臟取血法留取血1～2 mL。頸正中暴露氣管，剪開(kāi)一小口插入導(dǎo)管并固定，向?qū)Ч軆?nèi)緩緩注入1 mL預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液反復(fù)回抽3 次，回收率80%～90%，留取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）?？焖偌糸_(kāi)胸腔，取出雙側(cè)肺臟，肉眼觀察后，用PBS沖洗；左上肺制成肺組織勻漿，右上肺組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度為5 μm，供免疫組化和組織學(xué)檢查用。

1.3 肺組織病理檢查

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后觀察肺組織病理學(xué)改變，以輻射狀肺泡計(jì)數(shù)（radical alveolar counts，RAC）評(píng)估肺泡發(fā)育程度，在100倍光鏡視野下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)肺泡數(shù)并取其均值。

1.4 ELISA法測(cè)定血清可溶性LRP1和MMP9水平

采血后室溫下靜置2 h，再置4℃冰箱3～4 h，待血液凝固血塊收縮后，4 000 r/min 離心10 min，取上清，保存于-80℃冰箱中。取BALF 于1 h 內(nèi)4 000 r/min 離心10 min，取上清，保存于-80℃冰箱中。采用可溶性LRP1（soluble LRP1，sLRP1）（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）、MMP9（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）ELISA試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清及BALF中相應(yīng)指標(biāo)的濃度。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白水平

肺組織勻漿用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，待測(cè)樣品以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后把膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜上，5%無(wú)脂奶粉封閉，分別與兔抗鼠GAPDH 多克隆抗體一抗（Gentex，美國(guó)）（稀釋度為1∶5 000）、兔抗鼠LRP1單克隆抗體一抗（Abcam，英國(guó)）（稀釋度為1∶5 000）、兔抗鼠Pyk2單克隆抗體一抗（Abcam，英國(guó)）（稀釋度為1∶5 000）、兔抗鼠pPyk2多克隆抗體一抗（Affinity，美國(guó)）（稀釋度為1∶2 000）、兔抗鼠MMP9多克隆抗體一抗（Proteintech，美國(guó)）（稀釋度為1∶2 000）孵育雜交，4℃過(guò)夜洗膜后，再加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后進(jìn)行顯色，曝光于X線膠片上，在圖像分析系統(tǒng)計(jì)算目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 Real-Time PCR法檢測(cè)mRNA相對(duì)表達(dá)量

TRIzol 法抽提2 組大鼠肺組織總RNA（美國(guó)Invitrogen公司），采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)LRP1 mRNA、MMP9 mRNA的表達(dá)變化，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)體系為20 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物 （10 μmol/L）各 0.8 μL， ROX 0.4 μL， cDNA 2.0 μL， dH2O 6.0 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線為95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。擴(kuò)增引物序列LRP1-F： 5'-CCACTATGGATGCCCCTAAAAC-3'， LRP1-R：5'-GCAATCTCTTTCACCGTCACA-3'；MMP9-F：5'-CCCTGCGTATTTCCATTCAT-3'， MMP9-R： 5'-AAACCCCACTTCTTGTCAGC-3'； GAPDH-F： 5'-CCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3'， GAPDH-R：5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生長(zhǎng)狀況

空氣組大鼠活動(dòng)良好、反應(yīng)靈敏、毛發(fā)光澤、膚色紅潤(rùn)，無(wú)異常表現(xiàn)。高氧組大鼠反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、活動(dòng)減少，毛發(fā)發(fā)澀、無(wú)光澤，皮膚蒼白、干燥，口周發(fā)紺，氧依賴表現(xiàn)明顯，體重增長(zhǎng)較空氣組緩慢（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠生后各時(shí)間點(diǎn)體重比較 （，g）

表1 兩組大鼠生后各時(shí)間點(diǎn)體重比較 （，g）

images/BZ_106_1284_764_1431_827.pngimages/BZ_106_1431_764_1504_827.pngimages/BZ_106_1504_764_1689_827.pngimages/BZ_106_1689_764_1874_827.pngimages/BZ_106_1874_764_2059_827.pngimages/BZ_106_1284_945_1431_1063.png空氣組高氧組8 8images/BZ_106_1431_945_1504_1063.pngimages/BZ_106_1504_945_1689_1063.png7.5±0.4 7.5±0.6images/BZ_106_1689_945_1874_1063.png10.6±0.6 9.8±1.7images/BZ_106_1874_945_2059_1063.png13.8±1.2 12.1±1.4第7天15.8±0.8 13.0±1.2 5.732＜0.001

2.2 大鼠肺組織病理變化

HE 染色結(jié)果顯示，空氣組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整；高氧組可見(jiàn)肺泡數(shù)減少，肺泡大小不均一，肺泡間隔水腫增厚及纖維化（圖1）。空氣組RAC值 （19.1±2.0） 大 于 高 氧 組 （13.2±1.7）（t=6.321，P＜0.05）。提示BPD小鼠模型構(gòu)建成功。

圖1 兩組大鼠肺組織病理切片

2.3 兩組大鼠sLRP1及MMP9水平變化

高氧組大鼠血清及BALF 中sLRP1、MMP9 水平均高于空氣組（P＜0.05），見(jiàn)表2～3。

表2 兩組大鼠血清中sLRP1及MMP9水平比較 （，pg/mL）

表2 兩組大鼠血清中sLRP1及MMP9水平比較 （，pg/mL）

注：［sLRP1］ 可溶性低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1；［MMP9］基質(zhì)金屬蛋白酶9。

231±94 1 332±376images/BZ_106_1284_2764_1549_2826.pngimages/BZ_106_1549_2764_1686_2826.pngimages/BZ_106_1686_2764_1965_2826.png8 8images/BZ_106_1965_2764_2243_2826.pngimages/BZ_106_1284_2945_1549_3063.png空氣組高氧組images/BZ_106_1549_2945_1686_3063.pngimages/BZ_106_1686_2945_1965_3063.png55±8 100±14images/BZ_106_1965_2945_2243_3063.png

表3 兩組大鼠BALF中sLRP1及MMP9水平比較 （，pg/mL）

表3 兩組大鼠BALF中sLRP1及MMP9水平比較 （，pg/mL）

注：［sLRP1］ 可溶性低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1；［MMP9］基質(zhì)金屬蛋白酶9。

MMP9 88±30 530±130 9.375＜0.001images/BZ_107_237_471_465_534.pngimages/BZ_107_465_471_642_534.pngimages/BZ_107_642_471_919_534.png8 8images/BZ_107_237_652_465_770.png空氣組高氧組images/BZ_107_465_652_642_770.pngimages/BZ_107_642_652_919_770.png13±6 76±21

2.4 Western blot 法檢測(cè)兩組大鼠肺組織勻漿蛋白表達(dá)變化

LRP1、MMP9 蛋白在高氧組的表達(dá)水平明顯高于空氣組（P＜0.05）。pPyk2蛋白在高氧組的表達(dá)水平較空氣組也明顯升高（P＜0.05），但Pyk2蛋白水平在兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 Western blot法檢測(cè)兩組大鼠肺組織勻漿LRP1、pPyk2、MMP9蛋白表達(dá)電泳圖

表4 兩組大鼠肺組織勻漿蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （）

表4 兩組大鼠肺組織勻漿蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （）

注：［LRP1］低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1；［MMP9］基質(zhì)金屬蛋白酶9；［pPyk2］磷酸化酪氨酸激酶2；［Pyk2］酪氨酸激酶2。

Pyk2 0.50±0.04 0.52±0.05 0.666 0.530images/BZ_107_237_2017_374_2073.pngimages/BZ_107_374_2017_438_2073.pngimages/BZ_107_438_2017_627_2073.png4 4images/BZ_107_627_2017_817_2073.pngimages/BZ_107_817_2017_1006_2073.pngimages/BZ_107_237_2187_374_2300.png空氣組高氧組images/BZ_107_374_2187_438_2300.pngimages/BZ_107_438_2187_627_2300.png0.69±0.06 0.94±0.09images/BZ_107_627_2187_817_2300.png0.60±0.05 0.79±0.07images/BZ_107_817_2187_1006_2300.png0.92±0.08 1.22±0.09

2.5 RT-PCR 法檢測(cè)兩組大鼠肺組織勻漿sLRP1及MMP9的mRNA水平變化

高氧組LRP1 mRNA 和MMP9 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均高于空氣組（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 兩組大鼠LRP1及MMP9的mRNA水平比較 （）

表5 兩組大鼠LRP1及MMP9的mRNA水平比較 （）

注：［LRP1］低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1；［MMP9］基質(zhì)金屬蛋白酶9。

MMP9 1.04±0.32 2.91±0.88 3.461 0.026images/BZ_107_239_2891_480_2947.pngimages/BZ_107_480_2891_635_2947.pngimages/BZ_107_635_2891_929_2947.png6 6images/BZ_107_239_3061_480_3174.png空氣組高氧組images/BZ_107_480_3061_635_3174.pngimages/BZ_107_635_3061_929_3174.png0.99±0.06 11.96±0.59

3 討論

BPD 易發(fā)生在接受機(jī)械通氣的早產(chǎn)兒中，并可能最終導(dǎo)致長(zhǎng)期肺部疾病［16］。然而，BPD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全了解，可能與肺泡和血管肺發(fā)育停滯、纖維化和慢性炎癥有關(guān)［17］。目前研究已發(fā)現(xiàn)，MMPs在BPD進(jìn)展中發(fā)揮著核心作用，主要影響B(tài)PD 肺發(fā)育停滯和組織重塑纖維化過(guò)程［18］，其中MMP9受到了高度重視。

本研究發(fā)現(xiàn)在高氧組出現(xiàn)肺組織間質(zhì)水腫，肺泡腔可見(jiàn)水腫液形成、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡出血；血清和BALF 中MMP9 水平均較空氣組明顯升高，肺組織勻漿中MMP9 蛋白表達(dá)也增加，與Tambunting 等［19］研究相符。MMP9 在 BPD 中的功能已被研究［20］，但其涉及的相關(guān)通路尚未明確。最新研究發(fā)現(xiàn)，MMP9的活性不僅受到其組織抑制劑 的 調(diào) 節(jié)［21］， 還 通 過(guò) ERK1/2［22］、 NF-κB［23］、STAT3［24］、TRPV4［25］、ADAM17［26］等蛋白介導(dǎo)在肺相關(guān)疾病中發(fā)揮作用。近年來(lái)，有人提出MMP9可能還與LRP1密切相關(guān)［27］。

LRP1目前在肺部疾病中的作用受到廣泛關(guān)注，在人類全基因組關(guān)聯(lián)研究中，LRP1 的單核苷酸多態(tài)性與人類肺功能相關(guān)［28］，在平滑肌細(xì)胞中LRP1的失調(diào)影響基線肺功能和氣道反應(yīng)性［29］；肺泡巨噬細(xì)胞上LRP1的表達(dá)介導(dǎo)其吞噬作用并調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放［4］；成纖維細(xì)胞中LRP1表達(dá)的失調(diào)可能導(dǎo)致收縮性肌成纖維細(xì)胞無(wú)限制擴(kuò)張，從而導(dǎo)致纖維化的發(fā)展［30］。另外，有文獻(xiàn)表明，LRP1與血管形成和新生血管有關(guān)［31］。LRP1通過(guò)蛋白水解從細(xì)胞表面脫落釋放出sLRP1。sLRP1可促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)的表達(dá)；還可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞外蛋白，阻止它們的內(nèi)吞作用［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，肺組織勻漿中LRP1 mRNA 及LRP1 蛋白表達(dá)均增加；高氧組血清和BALF 中sLRP1 水平均較空氣組升高，而我們前期臨床研究中的BPD患兒血清sLRP1水平升高，這提示LRP1 在高氧誘導(dǎo)的肺損傷及BPD發(fā)病中可能具有重要作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)LRP1 與MMP9 表達(dá)水平呈正相關(guān)，有研究認(rèn)為L(zhǎng)RP1不僅介導(dǎo)MMP9的內(nèi)吞作用，還作為膜受體傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，誘導(dǎo)MMP9 表達(dá)［33］。但是LRP1 在高氧誘導(dǎo)肺損傷中調(diào)控MMP9的具體機(jī)制尚未清楚。

本研究結(jié)果顯示，在高氧組中肺組織勻漿pPyk2 表達(dá)增加。Pyk2 在多種疾病中發(fā)揮重要作用：在氣道高反應(yīng)性疾病中，Pyk2 磷酸化水平升高，會(huì)導(dǎo)致囊性纖維化氣道平滑肌功能異常［34］；Pyk2 可通過(guò)激活缺氧誘導(dǎo)因子而加重肺動(dòng)脈高壓［35］；在缺血再灌注后，Pyk2 激活原存活信號(hào)分子，防止活性氧過(guò)度增加，從而對(duì)缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用［36］。Revuelta-López 等［13］證實(shí)了在缺氧相關(guān)的血管疾病中存在LRP1-pPyk2-MMP9信號(hào)通路，LRP1 可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)鈣水平，上調(diào)富含脯氨酸的Pyk2磷酸化，誘導(dǎo)MMP9表達(dá)增加。其研究結(jié)果表明心肌梗死后心肌成纖維細(xì)胞LRP1水平在MMP9表達(dá)上調(diào)及心室重構(gòu)相關(guān)機(jī)制中發(fā)揮重要作用［14］，并強(qiáng)調(diào) LRP1-pPyk2-MMP9 軸參與了血管細(xì)胞遷移過(guò)程［37］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在高氧誘導(dǎo)新生大鼠肺損傷中，肺組織LRP1表達(dá)上調(diào)，Pyk2磷酸化水平增加，MMP9水平升高，提示LRP1-pPyk2-MMP9通路可能參與了BPD 的發(fā)病機(jī)制，但本文未對(duì)這條通路上下游行進(jìn)一步干預(yù)研究，如基因敲除或過(guò)表達(dá)等，未來(lái)針對(duì)這條通路的研究可能為BPD的發(fā)病研究提供新的思路。