萬 敏，邵 銳

(1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室，山東 青島 266237)

維生素D作為一種類固醇激素在維持動物體內(nèi)鈣磷代謝穩(wěn)態(tài)、促進骨骼發(fā)育等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。維生素D的主要形式包括維生素D2(VD2，麥角鈣化醇)和維生素D3(VD3，膽鈣化醇)；前者主要存在于植物中，后者是動物體內(nèi)的主要存在形式。VD3可以通過動物皮膚中7-脫氫膽固醇經(jīng)陽光中紫外線照射形成，也可以通過食物獲??；而動物體內(nèi)的VD3可被代謝轉(zhuǎn)變?yōu)?5-羥基維生素D3[25(OH)D3]以及1α, 25-二羥基維生素D3[1α, 25(OH)2D3]。最初的研究顯示VD具有預(yù)防佝僂病的作用，近些年越來越多的研究表明VD除了傳統(tǒng)已知的調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷吸收以及骨質(zhì)礦化的作用以外，還具有十分廣泛的生理學(xué)作用，包括調(diào)控免疫系統(tǒng)、抗炎抗感染、抵御癌癥、調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝以及腸道菌群等功能[1-2]。已有的研究表明VD主要通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮其廣泛的生理學(xué)功能。

與高等動物相比，魚體內(nèi)VD3的代謝調(diào)控及其功能的研究相對較少。本文總結(jié)了動物體內(nèi)VD3的來源以及不同魚類VD的需求量，同時重點比較了魚類和高等動物對于VD3的來源、代謝以及VDR的差異，并概述了VD3對于魚類生理功能調(diào)控的研究進展。

1 維生素D3的來源

2 維生素D的需求量

Barnett等以虹鱒為研究對象，于1979年首次證明了魚類飼料中添加VD的重要性[9]，而魚類VD缺乏癥表現(xiàn)為表皮層變薄、底層肌肉組織壞死以及血鈣濃度明顯降低等[10]。根據(jù)美國科學(xué)院國家研究委員會(NRC)在2011發(fā)布的水產(chǎn)動物營養(yǎng)需求量，不同魚類的VD營養(yǎng)需求量有很大的差異。重要的淡水養(yǎng)殖魚類羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)、斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)以及虹鱒達到最佳生長狀態(tài)時，其飼料中VD的最低添加量分別為360、500和1 600 IU/kg；而具有代表性的幾種海水魚類的VD最低需求量未見報道[11]。根據(jù)中國水產(chǎn)飼料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，冷向軍總結(jié)了中國幾種常見養(yǎng)殖魚類(草魚、青魚、鯉魚、鯽魚、羅非魚和長吻鮠)配合飼料中維生素D推薦添加量為400～2 000 IU/kg[12]。

盡管大部分魚對過量的VD3表現(xiàn)出較高的耐受性，飼料中添加過量VD3并不會明顯影響魚體的生長指標(biāo)[13-14]。例如挪威食品安全局建議魚類，尤其是鮭科類，飼料中VD3含量的安全上限可達60 000 IU/kg(1.5 mg/kg)[14]。但是在其它魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，用添加過量VD3(200 000 IU/kg)的飼料投喂團頭魴(Megalobramaamblycephala)3個月之后，其腸道和肝臟組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同程度的損傷，同時魚體的免疫功能及抗感染能力都明顯下降[15]。與此相似，當(dāng)飼料添加過量的VD3(200 000 IU/kg)或1α,25(OH)2D3(20 000 IU/kg)時，牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼魚的死亡率及腹面色素沉著比例升高，脊柱畸形比例顯著增加[16]；而用含有過量VD3(≥19 200 IU/kg)的飼料投喂歐洲鱸(Dicentrachuslabrax)的幼魚也會嚴(yán)重影響魚體的骨質(zhì)礦化，并導(dǎo)致骨骼發(fā)育畸形，同時損傷其腸道發(fā)育及鈣吸收功能[17]。 因此歐洲食品安全局的動物飼料添加劑專責(zé)組設(shè)定魚類飼料中的VD3安全添加上限為3 000 IU/kg(0.075 mg/kg)[14]。

由于不同生活習(xí)性、不同食性以及不同生長階段的魚類對于維生素D需求量可能存在巨大的差異，而目前研究數(shù)據(jù)顯示的魚類最佳生長狀態(tài)時飼料中VD的添加量范圍也并不一定與其最佳免疫狀態(tài)的需求量吻合，因此在未來的研究中需要進一步完善不同魚類在不同生長階段以及不同生理狀態(tài)下維生素D需求量的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。

3 維生素D3的代謝過程

維生素D的代謝過程具有較高的進化保守性[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)，魚類具有與高等動物相似的維生素D體內(nèi)代謝途徑以及維生素D代謝酶，但是兩者之間仍存在一定的差異。首先，高等動物中25(OH)D3被轉(zhuǎn)運至腎臟進行第二次羥基化，但是魚類的肝臟也具有1α-羥化酶活性，因此25(OH)D3也能在魚類的肝臟中進行第二次羥基化[21-22]，而Graff等在檢測了不同魚種的不同組織器官中VD3代謝物的含量之后也推測VD3代謝的組織特異性在魚類中比人類要低[23]。其次，人類血液中25(OH)D3含量通常比1α,25(OH)2D3要高得多，血液25(OH)D3含量也是評價人體VD3含量的主要指標(biāo)，但是魚類血液中1α,25(OH)2D3是VD3代謝物的主要循環(huán)形式，其含量可達到人類血液中的幾倍甚至幾十倍[13]。此外，某些深海魚類的肝臟與脂肪組織中VD3的含量遠遠高于陸地脊椎動物[4]。這些魚類肝臟與脂肪組織中的VD3大部分是以長鏈脂肪酸酯化的形式貯存，在正常情況下不會被分解代謝，而長鏈脂肪酸酯化VD3僅是哺乳動物組織中VD3非常小的組成部分[8]。

圖1 動物體內(nèi)維生素D3的代謝過程圖示

在高等動物中1α,25(OH)2D3的合成與代謝受到嚴(yán)格的調(diào)控，已有的研究發(fā)現(xiàn)血鈣濃度、甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone, PTH)、成纖維細胞生長因子23(FGF23)以及1α,25(OH)2D3本身都能夠調(diào)節(jié)腎臟中CYP27B1的表達以及1α,25(OH)2D3的合成[1, 20]，而最近的研究結(jié)果闡明小鼠的腸道菌群通過影響FGF23的表達進而調(diào)控體內(nèi)VD3代謝[24]。在魚類中有關(guān)VD3代謝調(diào)控的研究相對較少，早期以虹鱒以及銀鰻(Anguillaanguilla)為研究對象的實驗結(jié)果表明水環(huán)境中的鈣離子濃度影響魚體內(nèi)VD3的代謝[25-26]；進一步的研究也證實虹鱒肝臟和腎臟的VD3代謝能力在淡水和海水中表現(xiàn)出明顯的差異[27]。而最新發(fā)表的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)虹鱒在缺氧的條件下體內(nèi)CYP2R1和CYP27B1的基因表達顯著下降，從而導(dǎo)致維生素D代謝異常[28]。此外，皮質(zhì)醇也能夠調(diào)節(jié)斑馬魚(Daniorerio)體內(nèi)VD3代謝進而促進魚體的鈣吸收[29]。

在高等動物中腎臟合成1α,25(OH)2D3的能力隨著年齡的增長而逐漸下降[30]。與此相似，研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)超過3月齡達到性成熟之后斑馬魚肝臟中CYP2R1和CYP27B1的表達急劇降低，而CYP24A1的表達明顯升高，同時血清中的1α,25(OH)2D3含量顯著降低[31]。由于1α,25(OH)2D3調(diào)控動物體腸道鈣吸收，這些發(fā)現(xiàn)也部分解釋了與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失現(xiàn)象。

4 維生素D受體 (VDR)

維生素D3主要是通過其活性形式1α,25(OH)2D3與核受體VDR結(jié)合以完成其生理學(xué)功能。當(dāng)游離的1α,25(OH)2D3以自由擴散的方式進入細胞后，迅速與VDR結(jié)合形成復(fù)合物[32]。該復(fù)合物與維甲酸視黃醇X受體(RXR)形成異二聚體，VDR-RXR異二聚體可與目標(biāo)基因啟動子區(qū)域VDR反應(yīng)元件(VDRE)結(jié)合，調(diào)控其mRNA的轉(zhuǎn)錄[33](見圖2)。VDR不僅存在于與骨骼生長和維持礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的細胞中，在大多數(shù)組織細胞中均有分布[33]，這也間接表明了1α,25(OH)2D3具有廣泛的生理學(xué)作用。

圖2 維生素D受體(VDR)的作用機制

目前已經(jīng)測定VDR基因序列的魚種如下：比目魚 (Paralichthysolivaceus)、青鳉(Oryziaslatipes)、河豚(Takifugurubripes)、棘魚 (Gasterosteusaculeatus)、大西洋鮭(Salmosalar)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、歐洲鱸、斑馬魚和虹鱒等[34-36]。與哺乳動物只具有一個VDR不同，大多數(shù)魚類的VDR存在兩個亞型(VDRα和VDRβ)，兩者的基因與蛋白質(zhì)序列極為相似，但通常分布于不同的組織器官中[34, 37-38]。在斑馬魚中的研究結(jié)果顯示幾乎在所有不同的組織中都能檢測到VDRα的基因表達，但是VDRβ基因僅僅在肌肉和卵巢中高表達[31]。在對斑馬魚和青鳉中兩個VDR亞型進行研究之后發(fā)現(xiàn)，盡管兩種魚的VDRα和VDRβ對1α,25(OH)2D3具有相似的親和力，但是VDRα與DNA結(jié)合能力顯著高于VDRβ，同時兩者對于轉(zhuǎn)錄輔因子的結(jié)合能力也有所不同，最終導(dǎo)致1α,25(OH)2D3與VDRα的結(jié)合表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)[35]。此外，當(dāng)斑馬魚VDRα與1α,25(OH)2D3結(jié)合時的活性構(gòu)象與人源VDR活性構(gòu)象極為相似，因此推測VDRα基因很可能與高等動物的同源[39]。而對于斑馬魚VDR功能的研究也進一步證實，VDRα主要與鈣磷代謝調(diào)節(jié)有關(guān)[40]，而VDRβ與心臟、內(nèi)耳等器官的發(fā)育密不可分[37, 41]。但是對于兩種VDR在魚體內(nèi)具體的分子作用機制仍需要更深入的研究。

5 維生素D3的生理功能

大量的研究結(jié)果已經(jīng)證實VD3除了調(diào)節(jié)動物體內(nèi)鈣磷穩(wěn)態(tài)，還具有十分廣泛的生理學(xué)作用，尤其是VD3對機體免疫系統(tǒng)的調(diào)控已成為高等動物中相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。在魚類的研究中，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)飼料中添加不同含量VD3會對魚體生長代謝以及相關(guān)調(diào)控基因表達產(chǎn)生廣泛的影響[42]；而水體中加入微量1α,25(OH)2D3也影響斑馬魚早期胚胎中千余種 RNA 的表達，包括編碼不同的轉(zhuǎn)錄因子、多肽激素以及多種與脂肪酸和氨基酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的RNA[43]。此部分將小結(jié)VD3調(diào)控魚體鈣磷及骨質(zhì)代謝、免疫系統(tǒng)以及其它生理學(xué)功能的研究進展。

5.1 維生素D3對鈣磷及骨質(zhì)代謝的影響

與高等動物相似，VD3也能夠調(diào)節(jié)魚體中鈣磷水平[13,44]。早期的研究結(jié)果表明VD3可以促進胡鯰(Clariasbatrachus)[45]、鯉(Cyprinuscarpio)[46]、大西洋真鱈(Gadusmorhua)[47]和黃鱔(Monopterusalbus)[48]等不同魚種血鈣水平的升高。在斑馬魚中進一步的機理研究發(fā)現(xiàn)1α,25(OH)2D3通過VDRα刺激上皮鈣通道(Epithelial calcium channel)基因表達，從而促進機體鈣離子的吸收以及血鈣水平的增加[40]。此外，鰓是魚類從環(huán)境中攝入Ca2+的重要器官之一，在很多硬骨魚類的鰓中均有VDR的表達[49-50]。與鈣離子不同的是，水體中磷含量通常很低，所以魚類主要從食物中攝取磷。已有的研究也報道了VD3提高美洲鰻(Anguillarostrata)[51]、刺鯰(Heteropneustesfossi-lis)[52]、胡鯰[45]和虹鱒[53]等血磷水平。腸道是動物體鈣磷吸收的重要場所，大量的研究也報道了魚類腸道高表達VDR[34,49]；而VD3也能夠調(diào)節(jié)美洲鰻腎臟對磷的再吸收[54]。近幾年的一項研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加適量的VD3可以提高黃顙魚腸道和腎臟中磷轉(zhuǎn)運體SLC34基因的表達，從而促進魚體內(nèi)磷的吸收利用[55]。維生素D3對魚類骨質(zhì)礦化和代謝的影響也有諸多報道，例如腹腔注射VD3能有效提高南極巖鱈魚(Pagotheniabernacchii)的骨質(zhì)礦化[56]，而水體添加VD3也增強斑馬魚幼魚的骨質(zhì)礦化[57]。此外，VD3也能夠直接影響金鯽魚(Carassiusauratus)成骨細胞的生成及活性[58]。

5.2 維生素D3 對免疫功能的影響

在魚類中的研究表明VD3影響魚類免疫系統(tǒng)及其抗菌能力。在大西洋鯛(SparusaurataL.)的投喂飼料中添加適量VD3可以顯著提高頭腎免疫細胞的吞噬能力和血清過氧化氫酶水平，但是對于血清補體活性以及白細胞呼吸爆發(fā)活性等免疫指標(biāo)無顯著差異[72]，而最近的一篇研究報道發(fā)現(xiàn)VD3能夠提高大西洋鮭原代巨噬細胞中白細胞趨化因子2(leukocyte-derivedchemotaxin2)的基因表達，同時VD3與巨噬細胞共孵育可降低沙門氏菌對巨噬細胞的粘附，從而提高巨噬細胞的抗菌能力[73]。

以建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)原代腸細胞為研究對象的實驗結(jié)果顯示1α,25(OH)2D3能有效抑制由脂多糖(LPS)激活的Toll樣受體4(TLR4)-髓樣分化初級應(yīng)答基因88(MyD88)信號通路，進一步動物學(xué)體內(nèi)實驗結(jié)果也驗證了VD3的抗炎作用，并能有效保護由LPS所導(dǎo)致的腸道損傷[74]。與此相似，在黃顙魚中的研究也證明了VD3的抗炎作用，實驗結(jié)果表明VD3可通過抑制脾臟中NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)感染后所引起的魚體固有免疫反應(yīng)，包括下調(diào)促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)等[75]。此外，免疫細胞膜上的主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex, MHC)可與抗原結(jié)合, 并呈遞給T淋巴細胞, 從而激發(fā)機體適應(yīng)性免疫反應(yīng)。近年的一篇研究報道顯示飼料中添加適量VD3顯著誘導(dǎo)黃顙魚小腸及腎臟中MHCclassII基因的上調(diào)表達，從而促進機體抵抗致病菌的侵入[76]。

與高等動物相似，VD3也能夠提高魚體內(nèi)抗菌肽的表達。黎德兵等發(fā)現(xiàn)在飼料中添加 500 IU /kg VD3可顯著提高黃鱔肝胰臟和頭腎中魚類抗菌肽鐵調(diào)素(Hepcidin)的表達量[77]；Dioguardi等的研究顯示VD3也能夠增強歐洲鱸腸道中抗菌肽鐵調(diào)素的基因表達，同時明顯提高腹腔巨噬細胞的噬菌能力[78]。而大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)胚胎細胞系CHSE-214與20 nmol/L維生素D3共孵育72 h之后，細胞中抗菌肽cathelicidin-2基因表達以及細胞的抑菌能力顯著升高[79]。

總體而言，VD3對魚類免疫系統(tǒng)的調(diào)控機制仍然知之甚少，尤其是VD3對魚體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的影響鮮有報道，而VD3對魚類免疫系統(tǒng)的調(diào)控是否存在有別于高等動物的作用機制仍有待進一步的探究。

5.3 維生素D3的其他功能

維生素D3除了上述對鈣磷代謝、骨骼形成以及免疫功能的影響以外，在調(diào)控動物體的發(fā)育、組織再生、營養(yǎng)代謝、腸道菌群等不同方面具有廣泛而重要的作用。最近在斑馬魚中的研究發(fā)現(xiàn)VD3能夠促進其心肌細胞增殖以及受損心臟的再生[80]；此外VD3也調(diào)節(jié)斑馬魚造血干細胞(HSPC)的體內(nèi)生成[81]。在高等動物中的研究表明1α,25(OH)2D3能夠作用于胰島β細胞，促使細胞內(nèi)Ca2+濃度以及胰島素受體mRNA表達水平升高從而加速胰島素合成[82-83]，因此VD3缺乏與肥胖、高血糖及相關(guān)代謝綜合征緊密相關(guān)。與高等動物不同，魚類的胰島素分泌水平較低，因此魚類被認(rèn)為是先天的“糖尿病患者”，而能否通過補充VD3來影響魚體內(nèi)糖代謝這個科學(xué)問題仍有待更多的研究來回答。此外，VD3對動物體的脂肪代謝也產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠血液中載脂蛋白含量隨25(OH)D3濃度增加而增加[84]，而載脂蛋白對動物體內(nèi)膽固醇水平具有重要的調(diào)節(jié)作用[85]；同時鈣和1α,25(OH)2D3也可調(diào)節(jié)脂肪細胞中脂肪酸氧化，并抑制脂質(zhì)合成[86]。針對斑馬魚早期胚胎的轉(zhuǎn)錄組檢測結(jié)果顯示1α,25(OH)2D3調(diào)控發(fā)育早期斑馬魚中的脂肪酸代謝[43]，而Peng等通過敲除斑馬魚中CYP2R1基因阻斷斑馬魚體內(nèi)1α,25(OH)2D3合成，進而導(dǎo)致成魚魚體出現(xiàn)明顯的脂肪堆積，同時也闡明了1α,25(OH)2D3通過線粒體生成的關(guān)鍵調(diào)控因子PGC-1α通路調(diào)節(jié)魚體的脂肪代謝[31]。

近幾年越來越多的研究結(jié)果揭示了VD3與腸道菌群的密切關(guān)聯(lián)。在高等動物中的研究顯示VDR基因突變對于腸道共生菌群具有顯著的影響，而利用維生素 D3代謝酶或者VDR基因敲除動物所獲得的實驗結(jié)果也表明維生素 D3信號通路的缺失導(dǎo)致腸道菌群的失衡，進而誘發(fā)各種代謝疾病[87-88]；而另一方面，在無菌小鼠中VD3的代謝也顯著下降[24]。到目前為止在魚類中未見任何有關(guān)VD與腸道菌群互作關(guān)系的報道，本研究團隊針對大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)的最新研究結(jié)果表明飼料中添加不同含量VD3對大菱鲆腸道菌群組成及多樣性有明顯的影響(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

6 研究展望

相較于高等動物，魚類中維生素D相關(guān)的研究尚處于起步階段，諸多方面的問題亟待更加深入的探究。根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，進一步探查不同生活習(xí)性的魚類在VD來源以及代謝調(diào)控方面的差異，極有可能獲得一些重要的新發(fā)現(xiàn)，同時也有利于人類更好地利用魚類VD作為優(yōu)質(zhì)的VD來源。其次，在魚類中不僅VD內(nèi)分泌的調(diào)控機制需要更深入的研究，同時VD在魚類中能否如在高等動物中那樣通過旁分泌或自分泌的方式發(fā)揮其生理作用也值得進一步的驗證。此外，前期的研究已表明VD3對魚類具有十分廣泛而重要的生理調(diào)控作用，因此探明VD3在魚類中未知的生理調(diào)控機制，尤其是在感染免疫、營養(yǎng)代謝、腸道菌群等方面將會是未來的研究熱點，這部分的研究內(nèi)容也將從比較生物學(xué)的角度為高等動物中的相關(guān)研究提供重要的參考。而深入分析魚類中兩種VDR亞型在這些生理過程中的作用機制將有助于進一步了解VD對魚類生理功能的分子調(diào)控機理，并有可能發(fā)現(xiàn)有別于陸生高等動物的獨特之處。以上的這些研究內(nèi)容將深化人們對不同動物體如何獲取和利用VD的認(rèn)知，為魚類VD的精準(zhǔn)需求以及代謝調(diào)控提供理論指導(dǎo)，進而在產(chǎn)業(yè)上優(yōu)化養(yǎng)殖魚類人工飼料的配制，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色健康的發(fā)展。