劉彥君，王云鵬

(1. 上海交通大學醫(yī)學院，上海 200003； 2. 中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003)

紫杉醇是一種植物體內(nèi)天然合成的二萜生物堿類藥用化合物，其本身具有高效的抗癌作用。1979年Schiff P.B 等[1]首次發(fā)現(xiàn)紫杉醇能夠抑制腫瘤細胞的紡錘體生成，從而揭示了其抗癌作用的機理。目前，紫杉醇主要應(yīng)用于臨床上治療卵巢癌和乳腺癌等多種類型的癌癥，由于其治療效果極佳，因此紫杉醇被稱作近十年以來科學家所發(fā)現(xiàn)的一種最有研究價值和治愈癌癥希望的藥物[2-4]。

一直以來，紫杉醇的生產(chǎn)是應(yīng)用上的瓶頸，治愈一位癌癥前期的病人需要兩到四株成年紅豆杉才能獲得足夠量的紫杉醇。這是因為其在紅豆杉植株中本身合成率較低，含量較少，且紫杉醇的化學結(jié)構(gòu)較為復雜，合成途徑及部分反應(yīng)原理尚未明確，因此運用化學合成的方法來獲得紫杉醇其難度較大，也正因為這兩種原因，紫杉醇的生產(chǎn)量一直較低，供需之間存在巨大的矛盾[5]。為了解決供需之間這一顯著矛盾，國內(nèi)外科學家一直致力于研究運用不同的方法來提高紫杉醇的合成產(chǎn)量[6-10]。

紫杉醇的生物合成途徑總共分為三個階段：紫杉烷環(huán)母核結(jié)構(gòu)的形成、側(cè)鏈苯基異絲氨酸的合成以及最終合成產(chǎn)物紫杉醇。前體紫杉烷合成途徑中主要涉及到兩種關(guān)鍵酶，第一種就是牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)，該酶是紫杉醇前體合成途徑中的一種關(guān)鍵的異戊烯轉(zhuǎn)移酶，其能夠催化異戊烯焦磷酸與甲基丙烯基焦磷酸生成二萜類化合物的一個共同前體——牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(GGPP)[11]。另外一種則是紫杉烯合酶(Taxadiene synthase，TS)，該酶位于GGPPS的下游，負責將生成的GGPP轉(zhuǎn)化為具有紫杉烷骨架的母體烯烴，是紫杉醇前體紫杉烷合成途徑中的限速酶，其表達量的高低同樣能夠顯著影響紫杉醇前體的產(chǎn)量[12]。由于這兩種酶在紫杉醇前體合成途徑中起到關(guān)鍵性作用，因此研究其編碼基因GGPPS和TDC1的表達特征便尤為重要。

金錫杉是一種南方紅豆杉的自然變異品種，成熟后其假種皮呈金黃色，經(jīng)過一系列檢測，發(fā)現(xiàn)其紫杉醇含量高于原種，因此，是一種重要的遺傳資源，具有一定的研究價值。以此為基礎(chǔ)，本研究擬采用分子生物學方法，檢測變異種材料中與紫杉醇前體合成代謝途徑相關(guān)的兩種關(guān)鍵酶基因GGPPS和TDC1的時空表達模式，揭示這兩個基因的表達特征，為深入研究紫杉醇的代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料 實驗材料主要取自于位于江蘇省無錫市的南方紅豆杉栽培品種‘金錫杉’(Taxuswallichianavar.maireicv.‘Jinxishan’)，分別采取春季‘金錫杉’的樹葉以及夏季‘金錫杉’的樹葉、樹皮、樹枝和果實，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酶與試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit) TakaRa公司產(chǎn)品；PCR試劑(Premix TaqTM，Code) TakaRa生物有限公司產(chǎn)品；RNA試劑盒OMEGA公司產(chǎn)品；溴化乙錠(EB) ；DNA 分子量標準(DL 2000 bp) TakaRa 生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中基因GGPPS(AF081514)和TDC1(U48796.1)的序列，利用Primer軟件進行引物設(shè)計，GGPPS上下游引物分別為：F：5’-GAGGGAAGCCCACAAATCAC-3’，R: 5’-CCACAACCTGAAGCAGAAGC-3’，產(chǎn)物長度為380 bp。TDC1上下游引物分別為：F：5’-GGGCACAGCCAAGTAGAACA-3’，R:5’-AATACATACAGGGC ACGCAG-3’，產(chǎn)物長度為429 bp。

1.2.2 生物信息學分析 開放閱讀框架預測由NCBI的ORF finder程序(http://www.ncbi.nih. gov/gorf/gorf.html)完成；蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的預測運用ProtParam程序(http://www. expasy.org/tools/protparam.html)和ProTDC1cale程序；跨膜區(qū)域預測由Tmhmm程序完成(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；蛋白質(zhì)亞細胞定位通過TargetP程序完成(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)；蛋白質(zhì)信號肽預測運用SignalP完成(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)。

1.2.3 RNA提取 總RNA的提取參照OMEGA公司的RNA提取試劑盒中的說明書的方法進行，提取的總RNA用紫外分光光度計進行定量檢測，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/h3>

1.2.4 cDNA合成 采用大連TaKaRa公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒中說明書上的cDNA合成體系，將2 μL的Oligo DT加入到8 μL的樣品RNA中，輕微混勻。70 ℃下反應(yīng)10 min后，迅速冰浴1 min，然后加入如下試劑：1 μL 10 mmol·L-1 dNTP Mixture，1 μL M-MLV(24 U/μL)，4 μL 5×RT buffer，0.5 μL RNase Inhibitor(40 U/uL)，3.5 μL DEPC H2O。混勻后低速離心，放入PCR儀中42 ℃反應(yīng)60 min，然后95 ℃終止反應(yīng)5 min，所得產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/h3>

1.2.5 半定量PCR擴增 選用一個內(nèi)參基因(18S rRNA)做參照標準來觀察比較GGPPS和TDC1在不同時期以及不同組織中的表達情況。PCR擴增體系：總體積25 μL，其中2.5 μL 10×PCR buffer，2 μL MgCl2(25 mmol·L-1)，0.5 μL 10 mmol·L-1 dNTP，1 μL primer-F(10 μmol·L-1)，1 μL primer-R(10 μmol·L-1)，1 μL cDNA，0.25 μL Taq酶(購自TaKaRa公司)，16.75 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃40 s，28個循環(huán)。72 ℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物取20 μL，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下拍照觀察，所有PCR擴增實驗重復兩次。

2 結(jié)果與分析

2.1 GGPPS和TDC1基因序列及其編碼蛋白的生物信息學分析

2.1.1 GGPPS和TDC1的序列特征 GGPPS的基因全長序列為1 889 bp，該基因能夠編碼393個氨基酸。運用Protparam程序預測發(fā)現(xiàn)其蛋白分子量約為42.7 kDA，等電點為5.58，是一種不穩(wěn)定的脂溶性蛋白。

TDC1的基因全長序列為2 700 bp，該基因能夠編碼862個氨基酸。運用Protparam程序預測發(fā)現(xiàn)其蛋白分子量約為98.0 kDA，等電點為5.28，是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.1.2 GGPPS和TDC1蛋白的特點分析 利用Tmhmm程序分析GGPPS和TS的跨膜區(qū)域，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白均沒有跨膜區(qū)域，不屬于跨膜蛋白，因此預測這兩種蛋白存在于膜內(nèi)；進一步通過TargetP程序?qū)GPPS和TS的亞細胞定位進行預測，結(jié)果如表1所示，這兩種蛋白的氨基酸序列中均含有線粒體靶向肽，因此屬于胞內(nèi)酶。同時運用SignalP-4.1 prediction程序?qū)@兩種蛋白的信號肽進行分析預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白沒有信號肽序列，屬于非分泌性蛋白。

表1 蛋白質(zhì)GGPPS和TS亞細胞定位預測結(jié)果

2.2 ‘金錫杉’各組織RNA提取

提取的‘金錫杉’各組織總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，顯示OD260/OD280的值均在1.8～2.0之間；1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，各組織的總RNA完整性較好，無降解現(xiàn)象，且純度較高，可應(yīng)用于后續(xù)實驗。

2.3 GGPPS基因的表達特征分析

2.3.1 不同季節(jié)時關(guān)鍵酶基因GGPPS的表達量分析 從‘金錫杉’葉片中GGPPS的表達水平圖2可以發(fā)現(xiàn)，春季和夏季葉片中均能檢測到GGPPS的表達，春季GGPPS的表達量比夏季明顯高，這表明GGPPS具有顯著得時間表達特異性。

((a)GGPPS表達量。The GGPPS expression；(b)內(nèi)參基因18S rRNA表達量。The 18S rRNA expression；M:DL 2000 marker，1：春季樹葉，2：夏季樹葉。M:DL 2000 marker，1：Spring leaves，2: Summer leaves.)

2.3.2 不同組織部位中關(guān)鍵酶基因GGPPS的表達量分析 同期對‘金錫杉’葉片、樹皮、樹枝和果實中GGPPS的表達情況進行檢測，結(jié)果如圖3所示，樹葉、樹皮、樹枝和果實中均能檢測到GGPPS的表達，樹葉中GGPPS表達量最高，樹枝和果實中次之，樹皮中表達量最少，結(jié)果表明GGPPS具有顯著的組織表達特異性。

((a)GGPPS表達量。The GGPPS expression；(b)內(nèi)參基因18S rRNA表達量。The 18S rRNA expression；M:DL 2000 marker，1：樹葉組織，2：樹皮組織，3：樹枝組織，4：果實組織。M:DL 2000 marker，1: Leaves，2: Barks，3: Branches，4: Fruits.)

2.4 TDC1基因的表達特征分析

2.4.1 不同季節(jié)關(guān)鍵酶基因TDC1的表達量分析 由圖4可知，季節(jié)的更迭與‘金錫杉’葉片中基因TDC1的表達情況之間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，具體表現(xiàn)為春季TDC1的表達量要略微高于夏季。這一結(jié)果表明基因TDC1同樣具有一定的時間表達特異性。

((a)TDC1表達量。The TDC1 expression；(b)內(nèi)參基因18S rRNA表達量。The 18S rRNA expression；M:DL 2000 marker，1：春季樹葉，2：夏季樹葉。M:DL 2000 marker，1：Spring leaves，2: Summer leaves.)

2.4.2 不同組織部位中關(guān)鍵酶基因TDC1的表達量分析 通過采用與檢測GGPPS表達情況相同的技術(shù)手段對‘金錫杉’樹葉、樹皮、樹枝和果實中TDC1的表達水平進行檢測分析，結(jié)果如圖5所示，TDC1的表達與GGPPS有所異同，TDC1同樣能夠在樹葉、樹皮、樹枝和果實中表達，但在樹皮中表達量最高，樹枝中表達量最少，這一結(jié)果表明基因TDC1同樣具有一定得組織表達特異性，但具體表達模式卻明顯區(qū)分于GGPPS。

((a)TDC1表達量。The TDC1 expression；(b)內(nèi)參基因18S rRNA表達量。The 18S rRNA expression；M:DL 2000 marker，1：樹葉組織，2：樹皮組織，3：樹枝組織，4：果實組織。M:DL 2000 marker，1: Leaves，2: Barks，3: Branches，4: Fruits.)

3 討論

‘金錫杉’是一種南方紅豆杉的自然變異品系，相比于原種其紫杉醇含量更加豐富，是一種更具有生產(chǎn)應(yīng)用價值的資源，但是對于其內(nèi)在的影響紫杉醇表達量的關(guān)鍵因素尚未有人報道。本研究選取了紫杉醇合成途徑中的兩種關(guān)鍵酶基因GGPPS和TDC1，運用生物信息學以及半定量PCR技術(shù)分析得出在‘金錫杉’中這兩種酶基因具有顯著得時空表達特異性，這表明當外界環(huán)境因素發(fā)生變化時，會顯著影響GGPPS和TDC1兩種酶基因的表達活性，從而進一步影響紫杉醇的最終產(chǎn)量。

生物酶的活性會顯著受到溫度、濕度以及酸堿度等外界環(huán)境因素的影響，其活性的高低是決定酶促反應(yīng)產(chǎn)物含量的關(guān)鍵性因素。蘆站根等[13]發(fā)現(xiàn)，光照條件對于紅豆杉植株的次生代謝反應(yīng)有顯著影響，相比于強光，紅豆杉植株利用弱光的能力更強，在遮蔭條件下，更適宜紅豆杉植株生長，有利于其次生代謝反應(yīng)及相應(yīng)同化產(chǎn)物的積累。Wheeler等[14]在對研究不同短葉紅豆杉的生態(tài)群落時發(fā)現(xiàn)水分條件也能夠?qū)χ仓甑拇紊x反應(yīng)產(chǎn)生影響，相比于溫暖、干凈的環(huán)境，紅豆杉植株在潮濕、涼爽的環(huán)境下，其紫杉醇含量要更高。結(jié)合以上兩點，推測在相對遮蔭、涼爽和潮濕的環(huán)境下，會更有利于紅豆杉植株的次生代謝反應(yīng)，春季時期，光照強度適宜，氣候潮濕，而夏季時期，太陽光強度較高，濕度較低，相比之下，春季時期的環(huán)境因素更有利于紅豆杉植株自身的次生代謝反應(yīng)，因此也能夠合成更多的紫杉醇，這也與本研究分析得出的GGPPS和TDC1兩種酶基因在春季時期表達活性更高這一結(jié)果相一致。我國的紅豆杉植株大多為自然資源，鮮少有能將其人工培育至成熟期的案例，期望這一結(jié)果能夠為人工栽培紅豆杉，提高其生存率提供一定的理論基礎(chǔ)。

處于成熟期的紅豆杉含有豐富的紫杉醇，但是在其不同組織部位中，紫杉醇含量卻有顯著地差異性。鄭德勇等[15]研究南方紅豆杉的不同組織對于紫杉醇含量影響時發(fā)現(xiàn)，樹皮中的紫杉醇平均含量為0.030 2%，分別為其針葉和木質(zhì)部中含量的7和9.8倍。李鄭娜等[16]運用熒光定位技術(shù)在研究銀杏中GGPPS的轉(zhuǎn)運機制時發(fā)現(xiàn)，其主要定位于植株的葉片中。本研究發(fā)現(xiàn)的GGPPS和TDC1兩種酶基因具有組織表達特異性這一結(jié)果也與上述研究有所關(guān)聯(lián)，GGPPS主要在植株的葉片中表達量較高，而TDC1主要在植株的樹皮中發(fā)揮表達活性，因此推測紅豆杉的樹葉和樹皮是進行紫杉醇合成反應(yīng)的重要場所，希望這一結(jié)果能夠為未來運用紅豆杉組織培養(yǎng)法來進行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇這一途徑提供了理論參考。

紅豆杉雖種類繁多，但部分品種間親緣性較高，其理化性質(zhì)存在一定程度的相似性[17]。徐敏等[18]基于ITS序列分析變異品系與近緣類群的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)黃色假種皮南方紅豆杉與南方紅豆杉原種的遺傳距離為0，與中國紅豆杉遺傳距離為0.010，因此我們推測在金錫杉中發(fā)現(xiàn)的GGPPS和TDC1兩種酶基因的表達特征可能同樣適用于原種及其他部分品系紅豆杉。

盡管本實驗主要發(fā)現(xiàn)了紫杉醇前體紫杉烷合成途徑所涉及的兩種關(guān)鍵酶基因GGPPS和TDC1的表達模式，但后續(xù)關(guān)于一系列紫杉烷的修飾反應(yīng)以及側(cè)鏈合成反應(yīng)所涉及的相應(yīng)酶基因的表達特征仍未清楚，這主要與其相關(guān)酶基因表達量較低相關(guān)，如何檢測這類酶基因的表達活性是下一步實驗研究的方向。