江 洲，許曦锃，傅 紅*

(1.福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司，福建省特種水產(chǎn)配合飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福清350308； 2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108)

脂肪酶是一種能夠催化中長(zhǎng)碳鏈酯類的酯鍵發(fā)生斷裂與逆向合成的生物催化劑[1]，在油脂加工等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。利用脂肪酶進(jìn)行酶法酯交換反應(yīng)以提高魚(yú)油甘油三酯原料的ω-3功能性脂肪酸含量，是近年來(lái)食品和飼料行業(yè)的研究熱點(diǎn)[2-6]。準(zhǔn)確測(cè)定酶活力這一關(guān)鍵性指標(biāo)，對(duì)脂肪酶在魚(yú)油產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用具有重要意義。

目前，脂肪酶活力的檢測(cè)主要有酸堿滴定法、紫外分光光度法、氣相色譜分析法、界面張力法、濁度法、酶聯(lián)免疫吸附法等[7-12]，雖然酶活力檢測(cè)方法眾多，但每種方法的底物條件和操作條件各不相同，影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。而且，商業(yè)化脂肪酶的酶活力檢測(cè)方法大多基于其水解反應(yīng)活力，即檢測(cè)其水解相應(yīng)底物的消耗量或者產(chǎn)物的生成量來(lái)表征酶活力大小。雖然理論上脂肪酶可以催化水解和酯化兩個(gè)可逆反應(yīng)，但某些具有很高水解活性的脂肪酶在非水相中可能無(wú)法表現(xiàn)出同樣能力的合成活性[13]。魚(yú)油酯交換反應(yīng)屬于非水相催化反應(yīng)，水解酶活力可能不足以全面準(zhǔn)確地反映其在非水相催化反應(yīng)中的酶活力特性。因此，本研究選用8種商品化脂肪酶，通過(guò)對(duì)比酸堿滴定法、分光光度法、氣相色譜法等多種酶活力的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，選擇適用于水解和酯交換兩種反應(yīng)體系的酶活力檢測(cè)方法，并分別應(yīng)用于魚(yú)油酶法水解和酯交換反應(yīng)體系，為高酶活脂肪酶在魚(yú)油工業(yè)中的應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

游離脂肪酶L1、L2、L3、L4：福建百特生物科技有限公司；L5：豬胰脂酶，購(gòu)于合肥博美生物技術(shù)有限公司；固定化酶L6、L7、L8分別是Novozyme 435、Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM，購(gòu)于丹麥諾維信公司。魚(yú)油原料、魚(yú)油乙酯：福建天馬科技集團(tuán)股份有限公司；薄層層析硅膠G為分析純：青島海洋化工有限公司；對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯為分析純：麥克林生化科技有限公司；三油酸甘油酯、正辛酸等均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890A氣相色譜儀、112-88A7HP-88毛細(xì)管色譜柱：美國(guó)Agilent公司；T6-X紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；ZD-2自動(dòng)電位滴定儀：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-501超級(jí)恒溫水浴鍋、HJ-4A磁力攪拌器：上海方瑞儀器有限公司；FA25型高剪切分散乳化機(jī)：上海FLUKO公司；CF16RX-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)：天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司；RE52-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 脂肪酶活力的測(cè)定

1.3.1 聚乙烯醇-橄欖油乳化法測(cè)定水解活力

通過(guò)聚乙烯醇和橄欖油的乳化體系，采用電位滴定法測(cè)定脂肪酶的水解活力[14]，一個(gè)水解活力單位(U)為脂肪酶1 min內(nèi)水解底物所釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.3.2 對(duì)硝基苯酚法測(cè)定水解活力

以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯(p-NPP)和水為底物、Tris-HCl為緩沖液，采用比色法測(cè)定脂肪酶水解產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚含量[15]。一個(gè)水解活力單位(U)為脂肪酶1 min水解底物所釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.3.3 正辛酸-三油酸甘油酯交換法測(cè)定酯交換活力

以三油酸甘油酯與正辛酸作為底物，在脂肪酶的催化下進(jìn)行?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，將正辛酸置換到甘油酯的鏈上，采用氣相色譜分析法測(cè)定脂肪酶的酯交換活力[16]。一個(gè)酯交換活力單位(U)為脂肪酶1 min催化l μg正辛酸轉(zhuǎn)移到三油酸甘油酯中所需的酶量。

1.3.4 對(duì)硝基苯酚法測(cè)定酯交換活力

以棕櫚酸對(duì)硝基苯(p-NPP)和乙醇為底物，在脂肪酶的催化下進(jìn)行酯交換反應(yīng)，采用比色法測(cè)定產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚含量[17]。一個(gè)酯交換活力單位(U)為脂肪酶1 min酯交換底物生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量。

1.4 酶促水解制備脂肪酸型魚(yú)油

將甘油三酯魚(yú)油與一定pH的磷酸緩沖溶液以2∶3的體積比混合，加入適量脂肪酶混合均勻，在酶的最適溫度和一定攪拌速度下水浴反應(yīng)16 h。待反應(yīng)結(jié)束后，萃取上層魚(yú)油，除去溶劑和水分，收集脂肪酸型魚(yú)油混合物，待測(cè)[18]。

1.5 脂肪酶催化魚(yú)油酯交換反應(yīng)

將魚(yú)油甘油酯原料、魚(yú)油乙酯和適量脂肪酶在燒杯中混勻反應(yīng)。加入丙酮終止反應(yīng)，離心除酶，用薄層層析法分離出甘油三酯，經(jīng)正己烷萃取后甲酯化，利用氣相色譜儀測(cè)定TG型魚(yú)油中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量[19-20]。

脂肪酸組分的氣相色譜分析條件[21]：載氣為純氮?dú)?，流速? mL/min，氫氣35 mL/min，空氣350 mL/min；進(jìn)樣口溫度250°C，F(xiàn)ID檢測(cè)器280°C。程序升溫：140°C保持5 min，以4°C/min程序升溫到220°C持續(xù)保持35 min。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次，利用SPSS 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表明存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶水解活力檢測(cè)方法的選擇

8種商業(yè)化脂肪酶的產(chǎn)品包裝上原標(biāo)識(shí)酶活如表1所示。采用聚乙烯醇-橄欖油乳化法測(cè)得的脂肪酶水解活力如圖1所示。結(jié)果表明，以橄欖油作為底物，游離脂肪酶中的L1、L3、L5的水解活力比較高，其中水解活力最高的是L5豬胰脂酶，達(dá)到97 500 U/g。固定化脂肪酶中，L8的水解活力為90 667 U/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于L6和L7的水解活力。

注：L1代表游離脂肪酶1；L2代表游離脂肪酶2；L3代表游離脂肪酶3；L4代表游離脂肪酶4；L5代表豬胰脂酶；L6代表Novozyme 435；L7代表Lipozyme TL IM；L8代表Lipozyme RM IM。下同。

Notes：L1～L4 represented the free lipase 1～the free lipase 4，respectively；L5 represented porcine pancreatic lipase；L6 represented Novozyme 435；L7 represented Lipozyme TL IM；L8 represented Lipozyme RM IM.The same as below.

對(duì)硝基苯酚法測(cè)得的脂肪酶水解活力如圖2所示。結(jié)果顯示，游離脂肪酶L2、L3、L5的水解活力較高，L4最低；而固定化脂肪酶中L8為522 U/g，高于L6和L7，這與聚乙烯醇-橄欖油乳化法測(cè)得的總體趨勢(shì)相似。但是，對(duì)硝基苯酚法測(cè)得水解活力最高的是L2，為34 942 U/g，與聚乙烯醇-橄欖油乳化法存在偏差。

聚乙烯醇-橄欖油乳化法和對(duì)硝基苯酚法兩種方法的實(shí)測(cè)水解酶活力相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)，如表1所示。從結(jié)果看出，聚乙烯醇-橄欖油乳化法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差基本在10%以下，顯著小于對(duì)硝基苯酚法。這可能是在橄欖油乳化體系中采用的均質(zhì)乳化提高了酶與底物相互作用的表面積，使脂肪酶充分接觸油水界面，促進(jìn)滴定結(jié)果較穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。另一方面，從反應(yīng)的底物特征看，和棕櫚酸對(duì)硝基苯相比，橄欖油與魚(yú)油水解和酯交換反應(yīng)的原料天然魚(yú)油甘油三酯的分子結(jié)構(gòu)更接近，能夠更準(zhǔn)確地反映酶法反應(yīng)中的底物特征。因此，聚乙烯醇-橄欖油乳化法更適用于篩選魚(yú)油水解反應(yīng)所需的高酶活特性所需的脂肪酶。

表1 不同方法測(cè)得脂肪酶水解活力和酯交換活力的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)

2.2 脂肪酶酯交換活力檢測(cè)方法的選擇

正辛酸-三油酸甘油酯交換法測(cè)定酯交換活力法是通過(guò)脂肪酶在非水相體系中酶促酯交換，使正辛酸和三油酸甘油酯發(fā)生?；D(zhuǎn)移，通過(guò)氣相色譜分析甘油酯中正辛酸的結(jié)合率反映酯交換活力[14]。該法測(cè)得8種脂肪酶的酯交換活力如圖3所示。結(jié)果顯示，固定化脂肪酶L6、L7、L8的酯交換活力高，L7和L8分別達(dá)到32 663 U/g 和19 933 U/g，但是游離脂肪酶的酯交換活力都較低，其中L1的酯交換活力高于其他游離脂肪酶。

對(duì)硝基苯酚法測(cè)得8種脂肪酶的酯交換活力，如圖4所示。結(jié)果顯示較高的是固定化脂肪酶L8和L6，分別為8.10 U/g和3.92 U/g，其他脂肪酶的酯交換活力都較低。

正辛酸-三油酸甘油酯交換法和對(duì)硝基苯酚法兩種方法測(cè)得的酯交換脂肪酶的酶活力值存在差異，但主要與實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)。酯交換反應(yīng)基于不同的反應(yīng)底物和類型，正辛酸-三油酸甘油酯交換法是脂肪酸與甘油酯類的?；粨Q反應(yīng)，對(duì)硝基苯酚法是醇與酯類的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，在酶活力的檢測(cè)應(yīng)用上，正辛酸-三油酸甘油酯交換法顯然更接近于魚(yú)油的酯交換反應(yīng)底物特征，并且此法中的薄層層析法除酸效果好，不易影響氣相色譜對(duì)辛酸結(jié)合率的測(cè)定，使得靈敏度高，結(jié)果較為準(zhǔn)確；而對(duì)硝基苯酚法雖然操作簡(jiǎn)便，但萃取時(shí)間較長(zhǎng)，目標(biāo)產(chǎn)物易分解，這也導(dǎo)致了正辛酸-三油酸甘油酯交換法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)硝基苯酚法(表1)。

2.3 脂肪酶的水解和酯交換活力的相關(guān)性

對(duì)比上述幾種脂肪酶活力的測(cè)定方法，確定了脂肪酶水解活力的測(cè)定采用聚乙烯醇-橄欖油乳化法，酯交換活力的測(cè)定采用正辛酸-三油酸甘油酯交換法。將兩種脂肪酶活力值用多種相關(guān)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行兩兩擬合，探究其水解活力(x)和酯交換活力(y)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其線性模型擬合方程為y=-0.083 5x+ 17 065.6，相關(guān)系數(shù)R2為0.071 5；冪指數(shù)擬合模型y=48 957.1x-0.156，相關(guān)系數(shù)R2為0.151 3；指數(shù)函數(shù)的單指數(shù)衰減擬合模型y=8 192.1+16 418.4e(-x/2 223)，相關(guān)系數(shù)R2為0.204 0。上述擬合曲線方程及相關(guān)系數(shù)顯示，酯交換活力大致隨水解活力的增大而減小，總體近似于負(fù)相關(guān)關(guān)系。這和Wu X Y等[22]在催化酯合成中發(fā)現(xiàn)脂肪酶粗酶液的水解活性和酯化活性相關(guān)系數(shù)較小的結(jié)果相一致。因此，在脂肪酶活力實(shí)際測(cè)定時(shí)，水解活力不能反映酯交換活力，兩者之間不能相互預(yù)測(cè)，實(shí)踐中需要對(duì)兩種酶活力逐一測(cè)定。

2.4 脂肪酶在脂肪酸型及酯交換型魚(yú)油產(chǎn)品中的應(yīng)用

選擇3種高水解活力的脂肪酶L1、L3、L5，利用酶促水解甘油三酯型精制魚(yú)油制備脂肪酸型魚(yú)油產(chǎn)品，其中原料魚(yú)油甘油酯的酸價(jià)為4.43 mg KOH/g；另選3種酯交換活力較高的脂肪酶L6、L7、L8，制備脂肪酸甘油三酯型魚(yú)油產(chǎn)品，反應(yīng)原料是甘油三酯型原料魚(yú)油和乙酯型精制魚(yú)油，兩者的EPA和DHA的總含量分別為29.5%和71.5%。從表2中可以看出，三種脂肪酸型魚(yú)油的酸價(jià)是水解前的25～30倍，其中L5脂肪酶水解魚(yú)油產(chǎn)物酸價(jià)達(dá)到137.61 mg KOH/g；魚(yú)油酯交換產(chǎn)物甘油三酯中EPA和DHA含量大大提高，其中固定化酶L8的富集效果最好，EPA和DHA總含量為55.38%，比原料魚(yú)油提高了26%。上述魚(yú)油產(chǎn)品中脂肪酶水解活力和酯交換活力的次序能夠和圖1、圖3結(jié)果相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明聚乙烯醇-橄欖油乳化法和正辛酸-三油酸甘油酯交換法分別適合于篩選魚(yú)油水解和酯交換反應(yīng)所需的脂肪酶。

表2 脂肪酸型及酯交換型魚(yú)油產(chǎn)品應(yīng)用

3 結(jié)論

以8種商品化脂肪酶為原料，研究適合于魚(yú)油水解反應(yīng)和酯交換反應(yīng)的脂肪酶及其酶活檢測(cè)方法，統(tǒng)一酶活力單位為U/g。通過(guò)對(duì)比聚乙烯醇-橄欖油乳化法和對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶的水解活力的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值可知，聚乙烯醇-橄欖油乳化法更適合于篩選魚(yú)油水解反應(yīng)所需的高酶活的脂肪酶。通過(guò)對(duì)比正辛酸-三油酸甘油酯交換法和對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶酯交換活力的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值可知，正辛酸-三油酸甘油酯交換法更適合于篩選魚(yú)油酯交換反應(yīng)所需的脂肪酶。一元一次線性模型、冪指數(shù)擬合模型和指數(shù)函數(shù)模型擬合顯示，水解酶活和酯交換酶活的相關(guān)系數(shù)值R2在0.07～0.20之間，兩者無(wú)顯著性相關(guān)，表明脂肪酶水解活力不能反映酯交換活力；聚乙烯醇-橄欖油乳化法和正辛酸-三油酸甘油酯交換法兩種酶活檢測(cè)方法分別應(yīng)用于魚(yú)油水解和酯交換反應(yīng)脂肪酶的效果良好。