李 明，趙連魁，李冬軍

(石家莊市人民醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

增生性瘢痕是嚴(yán)重?zé)齻蠡颊咂つw恢復(fù)所面臨的主要問題[1]，也是嚴(yán)重?zé)齻颊呋貧w社會的重要阻力，因此增生性瘢痕的防治一直以來是燒傷整形領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。在許多生理過程中，微量元素鐵作為許多酶的金屬協(xié)同因子起著關(guān)鍵作用。秦澤蓮等[2]研究發(fā)現(xiàn)鈣、鎂、鋅、鐵和銅含量在增生性瘢痕組織中較自身正常皮膚減少，并推測鐵等微量元素的減少在增生性瘢痕的形成過程中起到一定作用，然而具體機(jī)制不明確。本研究通過檢測燒傷后增生性瘢痕患者血中鐵元素相關(guān)指標(biāo)及增生性瘢痕組織中鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，分析增生性瘢痕組織中鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的特點(diǎn)與增生性瘢痕形成的關(guān)系，旨在為燒傷后增生性瘢痕的治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1一般資料 選擇2016—2018年在石家莊市第一醫(yī)院燒傷整形外科住院、有增生性瘢痕典型癥狀體征的15例燒傷患者作為增生性瘢痕組，男12例，女3例；年齡25～52歲；病程2～11年。選擇同期因外傷或美容手術(shù)受術(shù)者15例作為正常組，男12例，女3例；年齡20～50歲。2組患者無家族性瘢痕增生史及金屬元素接觸史，無影響鐵代謝的相關(guān)疾病，術(shù)前未采用任何防治瘢痕的治療，術(shù)前均簽署患者知情同意書。本研究通過石家莊市第一醫(yī)院倫理論證。

1.2標(biāo)本采集及留存 增生性瘢痕組分別采集患者瘢痕及其自身正常皮膚組織標(biāo)本。瘢痕分別取材于面頸部、肩背部及上肢；正常皮膚取自同一患者全厚皮片移植剩余部分，取材于上肢、腹部及下肢。術(shù)中采集標(biāo)本至液氮中保存。

1.3主要試劑 兔抗大鼠多克隆FTL一抗、 兔抗大鼠多克隆FPN1一抗、鼠抗人單克隆TfR1一抗、兔抗大鼠多克隆DMT1+IRE一抗、兔抗大鼠多克隆DMT1-IRE一抗、兔抗人多克隆β-actin一抗均為Alpha Diagnostic International，USA產(chǎn)品；HRP-耦聯(lián)的山羊抗小鼠IgG單抗、HRP-耦聯(lián)的山羊抗兔IgG單抗為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，PVDF 膜為美國 Millipore 公司產(chǎn)品，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1靜脈血中鐵代謝相關(guān)指標(biāo) 術(shù)前取2組患者靜脈血，提取血清，送檢驗(yàn)科檢測血清鐵、總鐵結(jié)合力、不飽和鐵結(jié)合力、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、轉(zhuǎn)鐵蛋白含量。

1.4.2皮膚組織中鐵含量 皮膚和瘢痕組織充分自然解凍，雙蒸去離子水洗滌6次，自然干燥24 h，稱重。稱取0.3 g，分別置于消化器中，加純硝酸2 mL，置70 ℃水浴加熱4 h，待樣品完全溶解，用100 ℃水浴加熱2～3 h，盡量保持消化器中溶液體積有0.5 mL；各管中加高氯酸0.1 mL，置于70 ℃水浴中加熱2 h，直至溶液呈清亮；然后將溶液移入定容管內(nèi)，分別用雙蒸去離子水定容于5 mL。用電感耦合質(zhì)譜分析儀測定其中Fe元素的含量。按公式計算樣品中Fe含量(μg/g)：定溶液微量元素含量(μg/g)×定容液體積(5 mL)/樣品重量(g)[3]。

1.4.3皮膚組織中鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)量 凍存瘢痕組織解凍勻漿，充分裂解，提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取蛋白樣品電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4 ℃ 封閉過夜，分別用FPN1，TfR1，DMT1+IRE，DMT1-IRE，F(xiàn)TL(1∶200) 和 β-actin 兔多克隆抗體(1∶1 000) 孵育，室溫輕搖 3 h，洗滌，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000) 室溫孵育，洗滌， ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，封存。利用Fujifilm Las-4000分析軟件統(tǒng)計目標(biāo)條帶的積分光密度，用β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白/ β-actin 表示蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1靜脈血中鐵、總鐵結(jié)合力、不飽和鐵結(jié)合力、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度及轉(zhuǎn)鐵蛋白含量 正常組和增生性瘢痕組血清鐵、總鐵結(jié)合力、不飽和鐵結(jié)合力、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度及轉(zhuǎn)鐵蛋白含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05) 。見表1。

表1 正常組和增生性瘢痕組血清鐵、總鐵結(jié)合力、不飽和鐵結(jié)合力、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度及轉(zhuǎn)鐵蛋白含量比較

2.2皮膚組織中鐵含量 正常組皮膚組織中鐵含量為(49.65±6.12)μg/g，與增生性瘢痕組自身正常皮膚組織中鐵含量(47.92±4.21)μg/g比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；增生性瘢痕組增生性瘢痕組織中鐵含量為(69.71±4.53)μg/g，明顯高于自身正常皮膚組織中鐵含量(P<0.05) 。

2.3皮膚組織中鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)情況 增生性瘢痕組增生性瘢痕組織中FTL、DMT1(+IRE)、 DMT1(-IRE)、FPN1表達(dá)量均明顯高于自身正常皮膚組織(P均<0.05)，TfR1表達(dá)量明顯低于自身正常皮膚組織(P<0.05)。見圖1。

圖1 Western blot檢測增生性瘢痕中鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

鐵作為機(jī)體必需的微量元素，參與人體內(nèi)眾多生化反應(yīng)，鐵代謝的紊亂可以導(dǎo)致多種常見疾病的發(fā)生[4-6]。鐵廣泛參與人體重要的生命代謝過程，直接或間接參與燒傷修復(fù)中的細(xì)胞免疫、傷口愈合及抗氧化反應(yīng)等多個環(huán)節(jié)[7-8]，鐵不足或鐵過多都會影響創(chuàng)面愈合[9]。目前，已有的研究多集中在燒傷后增生性瘢痕組織中各種微量元素含量的變化，而有關(guān)其進(jìn)一步的發(fā)生機(jī)制鮮有研究。本實(shí)驗(yàn)探討了鐵代謝相關(guān)蛋白在燒傷增生性瘢痕中的表達(dá)及其關(guān)系。

增生性瘢痕多來源于重度燒傷、創(chuàng)傷，而重度的燒傷、創(chuàng)傷在傷后早期及后續(xù)創(chuàng)面修復(fù)過程中，由于創(chuàng)面滲液劇增、大量紅細(xì)胞丟失破壞等造成包括鐵元素在內(nèi)的各種微量元素在體內(nèi)出現(xiàn)各種各樣的改變，其中鐵往往處于缺乏狀態(tài)[10]。因此，有學(xué)者指出對于嚴(yán)重?zé)齻?、?chuàng)傷患者，在傷后及時適量補(bǔ)充鐵等微量元素，將有利于機(jī)體組織損傷修復(fù)，增強(qiáng)抗氧化酶活性[11]，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，從而促進(jìn)創(chuàng)面盡早愈合。重度燒、創(chuàng)傷患者經(jīng)抗感染、營養(yǎng)支持治療后，機(jī)體各物質(zhì)代謝、能量代謝趨于正常，血清中鐵等微量元素含量基本恢復(fù)正常，但在創(chuàng)傷局部，由于細(xì)胞增殖旺盛，會富集大量的供給細(xì)胞生長的鐵，這些鐵一方面促進(jìn)了創(chuàng)面局部細(xì)胞增殖，另一方面也會帶來氧化損傷[8]。又由于燒傷造成的局部微循環(huán)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，組織難以得到足夠氧供，低氧也可能觸發(fā)損傷局部組織中各類生長因子分泌失衡[12-13]，從而導(dǎo)致膠原合成大量增加，局部修復(fù)異常，而異常的瘢痕組織結(jié)構(gòu)又進(jìn)一步加重局部組織的低營養(yǎng)狀態(tài)，形成惡性循環(huán)[2]。

本研究檢測增生性瘢痕患者和正常健康人群的血清鐵、總鐵結(jié)合力、不飽和鐵結(jié)合力、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度及轉(zhuǎn)鐵蛋白含量，結(jié)果各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；檢測皮膚組織中鐵含量發(fā)現(xiàn)，正常健康人皮膚組織中鐵含量與增生性瘢痕患者自身正常皮膚組織中鐵含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，增生性瘢痕患者增生性瘢痕組織中鐵含量明顯高于自身正常皮膚組織中鐵含量。由此推測，增生性瘢痕患者機(jī)體整體處于鐵平衡狀態(tài)，而在增生性瘢痕局部鐵過載。這與既往的研究結(jié)果并不一致[2]，可能是所取的瘢痕組織分別在創(chuàng)面修復(fù)的不同階段，局部微量元素的變化可能不同，這有待加大樣本量結(jié)合準(zhǔn)確評估瘢痕形成時間做進(jìn)一步研究。

細(xì)胞通過鐵的吸收、貯存和利用之間的協(xié)同調(diào)節(jié)來維持其鐵穩(wěn)態(tài)。鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory protein,IRP)是胞漿內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白，能感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的鐵濃度，控制這些蛋白的翻譯，以維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)[14]。細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)鐵含量下降時，與多種鐵代謝相關(guān)蛋白(TFR1、DMT1等)mRNA 3’端UTR的鐵反應(yīng)元件(iron responsive element,IRE)相結(jié)合，增加其基因的穩(wěn)定性，從細(xì)胞外攝入鐵的DMT1、TfR1蛋白表達(dá)增加，即細(xì)胞的攝鐵能力隨之增強(qiáng)；此時FPN1 5＇IRE與IRP 結(jié)合，F(xiàn)PN1 的翻譯被抑制，釋鐵蛋白FPN1表達(dá)下降，鐵從細(xì)胞內(nèi)向外的輸出隨之減少[3]，反之亦然。通過上述機(jī)制，IRP/IRE調(diào)節(jié)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的精密調(diào)控[10]。在異常增生瘢痕中，膠原細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等各種細(xì)胞通過IRP/IRE調(diào)節(jié)系統(tǒng)攝入鐵來滿足自身生長增殖、清除活性氧的需要；然而攝入的鐵過多，會使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鐵過載，在IRP/IRE調(diào)節(jié)系統(tǒng)的作用下，TfR1、DMT1(+IRE)、DMT1(-IRE)表達(dá)下降，從而減少由胞外攝入鐵；同時FPN1表達(dá)升高，增加胞內(nèi)鐵釋放，來維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)。本研究結(jié)果顯示,增生性瘢痕組織中FTL、DMT1(+IRE)、DMT1(-IRE)、FPN1表達(dá)量均明顯高于自身正常皮膚組織，推測可能是由于增生性瘢痕組織中鋅、銅等二價金屬離子的含量較低[2]，DMT1(+IRE)、DMT1(-IRE)是細(xì)胞的主要二價金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體，對這些微量元素均有攝取轉(zhuǎn)運(yùn)作用，為維持這些二價金屬離子的胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞內(nèi)DMT1(+IRE)、DMT1(-IRE)的表達(dá)升高，以攝取所需要的二價金屬離子；TfR1表達(dá)量明顯低于自身正常皮膚組織，推測其原因可能是皮膚組織中TfR1本底表達(dá)較低[15]，TfR1在增生性瘢痕組織之中因細(xì)胞內(nèi)鐵的增加而表達(dá)下降。根據(jù)上述結(jié)果，推測在皮膚組織中，通過細(xì)胞內(nèi)IRP/IRE調(diào)節(jié)系統(tǒng)，鐵的攝取與釋放主要依賴于TfR1和FPN1的作用，而DMT1 (+IRE)、DMT1 (-IRE)在其中的作用微弱，但這仍需進(jìn)一步證實(shí)。此外，也許另有其他未知調(diào)節(jié)因素在鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)過程中發(fā)揮作用。

綜上所述，燒傷后增生性瘢痕患者全身處于鐵穩(wěn)態(tài)，瘢痕局部鐵元素沉積過多，細(xì)胞主要依賴于TfR1以及FPN1的作用調(diào)節(jié)鐵的攝取和釋放。本實(shí)驗(yàn)從分子水平豐富了增生性瘢痕發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，為燒傷后增生性瘢痕的治療提供了新的作用靶點(diǎn)，但本實(shí)驗(yàn)樣本量少，需擴(kuò)大樣本量對上述結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。