黃 雁，李 月，趙 晶，陳 明

(1.大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116600 )

0 引 言

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為革蘭氏陰性致病菌，在水體中廣泛存在，能夠感染多種魚類并引發(fā)敗血癥，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟損失[1-3]。嗜水氣單胞菌的致病性與毒力因子的表達密切相關[4]。目前針對嗜水氣單胞菌的毒力基因，多采用實時熒光定量PCR技術研究其轉(zhuǎn)錄水平，在蛋白表達水平上的研究分析較少。Western Blot技術可通過特異性抗體釣取目的蛋白，能夠更直觀準確的檢測不同條件下毒力蛋白的表達變化，而選取穩(wěn)定表達的內(nèi)參蛋白是保障該技術分析準確的先決條件[5-6]。然而，目前尚無嗜水氣單胞菌內(nèi)參蛋白的研究報道，限制了對嗜水氣單胞菌毒力蛋白表達及調(diào)控的深入研究。

已有報道recA和gap在某些微生物中可作為熒光定量PCR的內(nèi)參基因[7-8]。嗜水氣單胞菌基因組注釋表明，recA編碼具有DNA修復功能的重組酶RecA，gap-2編碼催化3-磷酸甘油醛生成1，3-二磷酸甘油酸的3-磷酸甘油醛脫氫酶Gap-2[9-10]。有報道鴨疫里默氏桿菌的RecA和大腸桿菌GADPH可作為兩種菌Western Blot的內(nèi)參蛋白[11-13]，同源性分析顯示，嗜水氣單胞菌與鴨疫里默氏桿菌RecA氨基酸序列同源性達到57.07%，Gap-2與大腸桿菌GADPH氨基酸序列同源性達到83.99%。因此，本實驗選取嗜水氣單胞菌RecA和Gap-2為研究對象，對兩種蛋白進行異源表達及抗體制備，并對其作為Western Blot內(nèi)參蛋白的表達穩(wěn)定性進行了評價，以期為嗜水氣單胞菌毒力蛋白表達及調(diào)控的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒

嗜水氣單胞菌A.hydrophilaATCC 7966，中國普通微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌E.coliDH5α、BL21(DE3)，北京全式金生物技術有限公司；質(zhì)粒pET-28a，本實驗室保存。

1.1.2 試 劑

細菌基因組DNA提取試劑盒，成都福際生物技術有限公司；AxyPrep Plasmid Miniprep Kit，康寧生命科學(吳江)有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；DpnI酶，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；IPTG、BSA封閉液、10×印跡膜轉(zhuǎn)印緩沖液、2′2-聯(lián)吡啶(Dip)、血紅素(Hemin)、TMB顯色液，生工生物工程(上海)股份有限公司；ECL化學發(fā)光底物，上海天能科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 重組表達載體的構建

NCBI中檢索A.hydrophilaATCC 7966的recA(AHA_3716)、gap-2(AHA_3618)基因序列，設計引物(表1)。提取A.hydrophilaATCC 7966基因組，以此為模板分別擴增1 065 bp的recA和996 bp的gap-2。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增成功后，采用RF克隆法將擴增產(chǎn)物分別與pET-28a載體連接，DpnI酶處理后，化學轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性重組子，對重組質(zhì)粒pET-28a-recA、pET-28a-gap-2進行電泳鑒定。選取大小正確的重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.2 重組蛋白RecA和Gap-2的誘導表達

將測序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-recA、pET-28a-gap-2分別轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)，接種于含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，待菌體濃度OD600達到0.7左右，添加IPTG至終濃度0.5 mmol/L，將溫度調(diào)至30 ℃誘導蛋白表達8 h。菌液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體。

1.2.3 重組蛋白RecA和Gap-2的純化

重組RecA和Gap-2蛋白設計帶有組氨酸標簽(His-tag)，可進行鎳離子親和層析純化。純化過程全程冰浴，用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0、150 mmol/L NaCl)重懸菌體，超聲破碎，將細胞裂解液于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清于親和層析柱中結合30 min，用含有30 mmol/L 咪唑的緩沖液洗脫雜蛋白，再用含有250 mmol/L咪唑的緩沖液洗脫目的蛋白。將洗脫液于4 ℃、5 000 r/min離心濃縮至5 mL，用凝膠過濾層析純化。

1.2.4 重組蛋白兔源多克隆抗體的制備及效價檢測

將純化的RecA和Gap-2蛋白對健康的4月齡雌性新西蘭大白兔進行注射免疫制備多克隆抗體。采用間接ELISA法對親和純化后的抗體效價進行測定：用0.05 mol/L碳酸鹽包被抗原(純化的RecA或Gap-2)，每孔0.2 μg，4 ℃孵育過夜。洗板后，用5%脫脂奶粉封閉。以純化抗體為一抗，倍比稀釋后孵育，以辣根酶標記山羊抗兔IgG為二抗，1∶8 000稀釋后孵育，加入TMB顯色液顯色后，在450 nm波長下測定OD。

1.2.5 Western Blot分析嗜水氣單胞菌RecA和Gap-2的表達穩(wěn)定性

以培養(yǎng)時期、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)環(huán)境中鐵離子濃度作為評價RecA和Gap-2表達穩(wěn)定性的影響因素。收集各培養(yǎng)條件下的菌體，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，于12%的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，以半干轉(zhuǎn)方式在80 V、40 min 條件下將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF膜上，用1%牛血清蛋白封閉2 h，“1.2.4”中制備的抗體按1∶10 000 稀釋后在4 ℃孵育過夜，辣根酶標記山羊抗兔 IgG以1∶10 000稀釋在室溫下孵育2 h，最后用ECL化學發(fā)光底物工作液進行顯影。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體的構建

從嗜水氣單胞菌基因組上擴增recA和gap-2，基因片段，分別與pET-28a連接，化學轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性重組子，提取重組質(zhì)粒進行電泳分析。結果如圖1所示，重組質(zhì)粒大小與預期相符。對大小正確的pET-28a-recA、pET-28a-gap-2重組質(zhì)粒進行進一步PCR驗證，擴增出大小正確的基因片段(結果未顯示)，送質(zhì)粒進行測序。

2.2 RecA和Gap-2重組蛋白分離純化

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)進行誘導表達，對目的蛋白進行層析純化及SDS-PAGE鑒定。由圖2可見，成功地誘導表達了兩重組蛋白，均主要以細胞內(nèi)可溶性蛋白的形式存在，親和層析純化后在觀察到較為單一且明顯的條帶(條帶6)，與His標簽融合重組蛋白RecA(39.7 ku)和Gap-2(37.4 ku)大小相符。

由圖3可以看出，收集得到的RecA和Gap-2蛋白純度較高。圖3(a)中有2個洗脫峰經(jīng)SDS-PAGE鑒定為目的蛋白，推測重組蛋白RecA在溶液中除單體外，還存在二聚體或多聚體的聚合形式。圖3(b)中重組蛋白Gap-2的吸脫峰有些拖尾，SDS-PAGE結果表明均為Gap-2，可能是分子篩柱效不良所致。

2.3 RecA和Gap-2抗體效價測定

用純化的RecA和Gap-2蛋白制備兔免疫血清，經(jīng)親和純化后獲得抗體。梯度稀釋抗體，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)，如表1所示，兩重組蛋白制備的抗體梯度均達到1∶512 000。

(a)RecA蛋白

表2 RecA和Gap-2抗體效價分析(OD450)Tab.2 Titer analysis of RecA and Gap-2 antibodies

2.4 Western Blot檢測RecA和Gap-2表達穩(wěn)定性

收取不同生長時期、不同生長溫度及鐵離子濃度差異環(huán)境中培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌，在各組上樣量一致的情況下進行Western Blot檢測，如圖4所示。RecA在不同溫度培養(yǎng)條件下表達較為穩(wěn)定；此外，RecA在OD600達到5時檢測到目的條帶明顯減弱，推斷是由于菌體處于生長穩(wěn)定后期，胞內(nèi)蛋白降解所導致的；另外有報道表明RecA在鐵離子濃度差異條件下能恒定表達[11]，但本研究中血紅素豐富環(huán)境下，嗜水氣單胞菌RecA表達略有降低，可能是血紅素濃度過高對菌體生長限制導致的。相比而言，Gap-2在不培養(yǎng)條件下表達較為恒定，這可能是由于其參與糖代謝，是微生物生命活動必需的酶。

圖4 Western Blot檢測蛋白RecA和Gap-2的表達Fig.4 Western Blot results of RecA and Gap-2 expression

目前recA、gap多被報道在不同培養(yǎng)條件下用作熒光定量PCR的內(nèi)參基因：如副溶血性弧菌中的recA在不同菌株和不同溫度培養(yǎng)條件下表達較為穩(wěn)定，萎縮果膠桿菌的recA在不同培養(yǎng)基、溫度以及培養(yǎng)階段表達均比較穩(wěn)定，巴西固氮瘤菌的recA在正常生長和細胞分化的應激條件下，均被評價為表達最穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一；而樺褐孔菌中gap在不同 pH、高溫刺激和菌核發(fā)育階段更適合作為內(nèi)參基因[14-15]。目前，RecA作為Western Blot內(nèi)參蛋白的報道僅見于鴨疫里默氏桿菌，而且僅在不同鐵離子濃度下進行了其表達穩(wěn)定性的分析。GADPH免疫抗體則僅用于不同源大腸桿菌的特異性識別，而缺乏該蛋白在不同條件下是否適合作為內(nèi)參蛋白的進一步評估[11-13]。本研究則在更多樣化的條件下評估了兩種潛在內(nèi)參蛋白的表達穩(wěn)定性，為嗜水氣單胞菌毒力蛋白的Western Blot檢測提供了有效參考。

3 結 論

本研究成功地對嗜水氣單胞菌中RecA和Gap-2蛋白進行了異源重組表達和分離純化，并制備了效價較高的多克隆抗體。用于考察嗜水氣單胞菌在不同培養(yǎng)時期、培養(yǎng)溫度及鐵離子濃度條件下RecA和Gap-2作為內(nèi)參蛋白的表達情況，Western Blot檢測結果表明，RecA在不同培養(yǎng)時期和鐵離子濃度條件下表達并不恒定，而Gap-2在3種培養(yǎng)條件下表達均穩(wěn)定表達，更適合作為嗜水氣單胞菌的內(nèi)參蛋白，也更有潛力作為廣泛生長條件下的內(nèi)參蛋白。