郭 梅，楊 帥*，王文重，魏 琪，董學(xué)志，毛彥芝，王 玲，李學(xué)敏，李學(xué)峰，劉雅萍，刁 琢，閔凡祥

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；3.牙克石森峰薯業(yè)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 牙克石 022150；4.大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院，黑龍江 加格達(dá)奇 165000）

由致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)上最具威脅的毀滅性病害[1]，其病原菌可通過游動孢子對馬鈴薯實施侵染，引起生長季植株葉片出現(xiàn)水浸狀軟化進(jìn)而萎蔫、枯死，同時還能傳導(dǎo)至薯塊并潛存其中引起腐爛，成為下一年馬鈴薯晚疫病大發(fā)生的主要初侵染源[2]。自1845年馬鈴薯晚疫病在愛爾蘭引起駭人聽聞的“大饑荒”事件至今，該病始終威脅著全球馬鈴薯健康生產(chǎn)，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)變化直接影響著病害的發(fā)生與流行[4]。近年來，隨著晚疫病菌表現(xiàn)型和基因型研究的更加深入，國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為A2交配型的存在是該病能在世界范圍內(nèi)頻繁發(fā)生和流行的主要原因[5]，這一發(fā)現(xiàn)也再次引起了國際社會的極大關(guān)注[6]。

相比于核基因組，線粒體基因組的結(jié)構(gòu)簡單、單親遺傳以及無組織特異性等特點，使其在監(jiān)測晚疫病菌遷移、流行及群體遺傳結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的研究中發(fā)揮重要作用[7]。目前，國內(nèi)外在線粒體DNA 多態(tài)性的研究方面主要采用PCR-RFLP法[8]。Griffith 和 Shaw[8]利用改進(jìn)的 PCR-RFLP 方法將線粒體單倍型分為Ia，IIa，Ib 和IIb 四種單倍型。四種單倍型在世界的不同國家和地區(qū)的分布情況不盡相同，但普遍認(rèn)為Ib 為舊群體，其他三種單倍型為新群體。目前國內(nèi)外主要是采用這種方法進(jìn)行晚疫病菌線粒體DNA 單倍型的檢測。

中國是世界馬鈴薯生產(chǎn)第一大國，種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一位[9]。黑龍江省因兼具極佳的地理位置和得天獨厚的冷涼氣候，成為中國重要的馬鈴薯種薯及商品薯主產(chǎn)區(qū)之一[10]。然而，由于近幾年黑龍江省馬鈴薯生長季節(jié)持續(xù)出現(xiàn)降雨量大且周期長等特殊天氣，馬鈴薯晚疫病在哈爾濱、綏化、克山等主要種植區(qū)發(fā)生十分嚴(yán)重。因此，本試驗通過系統(tǒng)分析近年來黑龍江省主產(chǎn)區(qū)及哈爾濱地區(qū)晚疫病菌線粒體DNA 單倍型情況，以期更好地了解黑龍江省晚疫病菌遺傳結(jié)構(gòu)組成，監(jiān)測群體變化動態(tài)，從而為晚疫病的深入研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為制定符合黑龍江省馬鈴薯生產(chǎn)的晚疫病防控策略提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試晚疫病菌分別于2015～2020 年采自黑龍江省哈爾濱、齊齊哈爾、綏化、鶴崗、伊春、黑河和大興安嶺7 個馬鈴薯生產(chǎn)區(qū)，所選帶病植株均帶有明顯晚疫病癥狀。采用常規(guī)組織分離法將帶病組織接于新鮮的薯塊上，18℃下恒溫培養(yǎng)約一周時間，至薯塊上長滿白色菌絲后，用無菌接種針挑取菌絲至黑麥培養(yǎng)基上，18℃下培養(yǎng)以獲取純化的晚疫病菌，實驗室保存、備用。

1.2 菌株基因組DNA 的提取

采用基因組DNA提取試劑盒提取經(jīng)分離、純化培養(yǎng)后獲得的晚疫病菌DNA。提取DNA后，利用微量核酸蛋白濃度測定儀檢測DNA 純度，當(dāng)OD260/OD280值大于1.8時，DNA符合后續(xù)試驗要求。

1.3 線粒體DNA 單倍型分析

采用 Griffith 和 Shaw[8]的 PCR-RFLP 方法進(jìn)行線粒體DNA 單倍型分析，引物信息見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用商品化PCR Mix 的20 μL 體系進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火 30 s，72℃延伸1 min，34 個循環(huán)；72℃下延伸5 min，4℃保存。之后利用內(nèi)切酶 Msp I 和 EcoR I 對 5 μL 的 PCR 產(chǎn)物于 37℃條件下進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，利用凝膠成像儀在紫外光下檢測并拍照。

表1 線粒體DNA 單倍型測定引物Table 1 Primers for detection of mtDNA haplotype

1.4 線粒體單倍型的鑒定原則

馬鈴薯晚疫病菌mtDNA 單倍型劃分標(biāo)準(zhǔn)參照Griffith 和Shaw[8]，根據(jù)相應(yīng)條帶在對應(yīng)位置上的有無，判斷菌株的單倍型類型，具體見表2。

表2 依據(jù)酶切片段劃分致病疫霉mtDNA 單倍型的標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Classification standard of mtDNA haplotypes of P. infestans by restriction fragment

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯晚疫病菌樣品采集及分離

2015～2020 年在黑龍江省哈爾濱、齊齊哈爾、綏化、鶴崗、伊春、黑河和大興安嶺7 個馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)共采集分離了193 份馬鈴薯晚疫病菌菌株樣品，具體信息如表3 所示。

表3 2015～2020 年黑龍江省晚疫病菌樣品采集信息Table 3 Information of P. infestans isolates collected from 2015 to 2020 in Heilongjiang Province

2.2 線粒體DNA 單倍型鑒定分析

由圖1 可知，P2 擴(kuò)增片段可以被MspI 酶切為720 和 350 bp 兩個片段，或是 720，203 和 147 bp三個片段，或者是641，350 和79 bp 三個片段，分別對應(yīng) 的 mtDNA 單倍型為 Ia 或 IIb 和 Ib 及 IIa。P4擴(kuò)增片段可以被EcoRI酶切為609和361 bp兩個片段，或者是394，361 和209 bp 三個片段，分別對應(yīng)的 mtDNA 單倍型為 IIa 或 IIb 和 Ia 或 Ib。當(dāng) P2擴(kuò)增片段經(jīng)MspI 酶切為720 和350 bp 兩個片段時，使用EcoRI 酶切P4 擴(kuò)增片段進(jìn)行驗證，當(dāng)?shù)玫?09 和361 bp 兩個片段時，該樣品的單倍型為IIb，當(dāng)?shù)玫?94，361 和209 bp 三個片段時，該樣品的單倍型為Ia。

圖1 線粒體DNA 單倍型檢測結(jié)果判斷電泳圖Figure 1 Electrophoresis for detection of mtDNA haplotypes

根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，2015～2020年黑龍江省7個馬鈴薯種植區(qū)的193份樣品中共發(fā)現(xiàn)3個基因型，分別為Ia、IIa 和 Ib。其中，172 份晚疫病樣品為 IIa 單倍型，占比89.12%，為優(yōu)勢線粒體DNA 單倍型；19份晚疫病樣品為Ia 單倍型，占比9.84%；2 份晚疫病樣品為Ib 單倍型，占比1.04%；所有樣品中未發(fā)現(xiàn)IIb 單倍型。從采集地點分析（表4），哈爾濱地區(qū)發(fā)現(xiàn)3 種mtDNA 單倍型，齊齊哈爾地區(qū)除發(fā)現(xiàn)Ia 和IIa 兩種單倍型，其他地區(qū)樣品均為IIa 單倍型。說明哈爾濱和齊齊哈爾地區(qū)馬鈴薯mtDNA單倍型類型復(fù)雜，其他地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌mtDNA 單倍型結(jié)構(gòu)單一。從采集年份分析，哈爾濱地區(qū)5 年來mtDNA 單倍型變化見圖2，除2017年Ia 單倍型占優(yōu)勢外，其他年份基本都是以IIa 單倍型為主，同時2019 年檢測發(fā)現(xiàn)Ib 單倍型的存在，說明哈爾濱地區(qū)年際間晚疫病菌的遺傳結(jié)構(gòu)存在動態(tài)變化。

圖2 哈爾濱地區(qū)晚疫病菌線粒體DNA 單倍型年度變化Figure 2 mtDNA haplotypes of P. infestans isolates collected from Harbin City

表4 黑龍江省晚疫病菌mtDNA 單倍型及其分布Table 4 mtDNA haplotypes and distribution of P. infestans isolates collected in Heilongjiang Province

3 討 論

基于線粒體DNA（mtDNA）的基因型研究是分析微生物地理來源方面的一個很有利的工具，利用此標(biāo)記可以追溯某些微生物的起源與演變路線[11]。由于致病疫霉線粒體DNA 結(jié)構(gòu)相對簡單且穩(wěn)定性良好，因此被廣泛用于致病疫霉菌的群體起源和演化研究[12]。2000 年以來，國內(nèi)學(xué)者對于線粒體DNA 多態(tài)性的研究主要是采用PCR-RFLP 方法[8]，對中國各省份馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的晚疫病菌的mtDNA基因型多樣性進(jìn)行了持續(xù)的研究與探討。趙志堅等[12]監(jiān)測2001 年云南省晚疫病菌mtDNA 單倍型發(fā)現(xiàn)群體主要以Ia 型為主；郭軍等[13]鑒定了內(nèi)蒙古地區(qū)晚疫病菌群體mtDNA 的單倍型，結(jié)果均為IIa 型；韓麗麗等[14]分析了 2010～2012 年 3 年間福建省晚疫病群體的mtDNA 單倍型類型和頻率分布，檢測結(jié)果為存在Ia、IIa 和IIb 三種單倍型，其中Ia 為優(yōu)勢基因型。

在黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌mtDNA 研究方面，前人對黑龍江省致病疫霉mtDNA 單倍型進(jìn)行了持續(xù)的報道，發(fā)現(xiàn)Ia、IIa、Ib 和IIb 四種線粒體單倍型[12,15-17]在黑龍江省均有存在，雖然不同時期檢測的結(jié)果有所差別，但均得出IIa 為優(yōu)勢基因型的結(jié)論。本研究分別對黑龍江省多地的馬鈴薯晚疫病菌菌株和哈爾濱地區(qū)連續(xù)多年的晚疫病菌群體進(jìn)行了線粒體DNA 單倍型測定分析，其中，哈爾濱、齊齊哈爾、綏化、伊春和大興安嶺地區(qū)均

采集到了較為充足的樣品用于mtDNA 的檢測，但黑河和鶴崗兩地受到當(dāng)?shù)靥鞖?、種植地塊以及田間防治水平的影響，只采集到較少的樣品用于本次檢測，其在代表性上相對不足，因此，也將在后續(xù)年份進(jìn)行持續(xù)的關(guān)注和報道。本研究結(jié)果表明哈爾濱地區(qū)有Ia、Ib、IIa 三種單倍型，齊齊哈爾有Ia、IIa 兩種單倍型，其他地區(qū)mtDNA 多態(tài)性單一，均為IIa 單倍型，所有地區(qū)均未檢測到IIb單倍型的存在。這一結(jié)果和前人對黑龍江省晚疫病菌群體的測定結(jié)果基本一致。已有研究報道認(rèn)為Ib 單倍型是致病疫霉菌全球遷移之前的“舊”群體，而其他三種類型則為后期衍生出來的“新”群體。多年來黑龍江省晚疫病菌mtDNA 單倍型分析結(jié)果表明，黑龍江省已基本完成馬鈴薯晚疫病菌群體的新舊群體演變過程，但受到氣候和環(huán)境變化的影響，在馬鈴薯生產(chǎn)過程中Ib 單倍型仍然可能發(fā)生，因此，對晚疫病菌群體變化開展科學(xué)、精準(zhǔn)、有效的監(jiān)測，對更好地進(jìn)行馬鈴薯晚疫病防控具有重要意義。