馬 陳 廖 奕 沈 霖 盧芙蓉 帥 波

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022

益氣活血方是沈霖教授治療出血性血小板病的經(jīng)驗方，經(jīng)20余年臨床驗證，該方在控制臨床出血癥狀、糾正血小板聚集缺陷及降低停藥1年后復(fù)發(fā)率等方面均明顯優(yōu)于常規(guī)西藥腎上腺色腙片[1]。近期臨床藥物試驗[2-3]提示，調(diào)控非活性的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein 2，iRhom2)及血小板膜糖蛋白Ⅴ(platelet membrane glycoprotein V，GP Ⅴ)的表達(dá)可能是益氣活血方治療出血性血小板病作用靶點(diǎn)之一。為了進(jìn)一步研究益氣活血方組方藥物的具體作用靶點(diǎn)以及作用機(jī)制，本研究通過人血標(biāo)本體外加藥的方法，觀察了全方、配伍組和單味藥組對出血性血小板病患者靜脈血中iRhom2及GP Ⅴ表達(dá)的影響，旨在探討益氣活血方治療出血性血小板病的作用機(jī)制及益氣活血中藥配伍的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月—2021年3月就診于本院中西醫(yī)結(jié)合科門診的33例出血性血小板病患者作為研究組，其中男9例，女24例；年齡(34.51±14.27)歲，年齡范圍為20～57歲；病程(7.18±5.26)年，病程范圍為2～13年。另選30例血小板聚集檢測無異常發(fā)現(xiàn)的健康獻(xiàn)血員作為正常對照組，其中男10例，女20例；年齡(33.27±8.26)歲，年齡范圍為21～55歲。2組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

研究組患者符合文獻(xiàn)[4]中出血性血小板病相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者有多部位出血臨床表現(xiàn)；按常規(guī)操作檢測患者血小板聚集最大聚集率，其中最大聚集率在21%～40%者為反應(yīng)不良，低于20%者為反應(yīng)缺如，患者對1項或多項誘聚劑誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)不良或缺如。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；在本研究前2周內(nèi)，未服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀類中藥等可能影響血小板功能的藥物；同意參與本項研究并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)內(nèi)科、血管外科、耳鼻喉科、婦科、口腔科和眼科等科室診視，發(fā)現(xiàn)診斷性出血病灶；合并其他臟器重大疾病且預(yù)后不佳者；精神類疾病或智力、語言障礙者；不愿意簽署知情同意書者。

1.4 體外干預(yù)方法

1.4.1 血液標(biāo)本的制備 采用真空采血管(美國BD公司)采集所有受試對象清晨空腹肘靜脈血，以3.8%枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝處理，血液與抗凝劑的比例為9：1。出血性血小板病患者靜脈血經(jīng)抗凝處理后分為12等份，每份0.75 mL血液標(biāo)本；健康獻(xiàn)血員靜脈血經(jīng)抗凝處理后取1份0.75 mL血液標(biāo)本。

1.4.2 中藥拆方及分組 ①全方組：黃芪10 g、黨參10 g、當(dāng)歸10 g、白芍5 g、桃仁5 g、甘草2 g；②益氣活血組(全方去甘草)：黃芪10 g、黨參10 g、當(dāng)歸10 g、白芍5 g、桃仁5 g；③黃芪當(dāng)歸組：黃芪10 g、當(dāng)歸10 g；④益氣組：黃芪10 g、黨參10 g；⑤活血組：當(dāng)歸10 g、白芍5 g、桃仁5 g；⑥黃芪組：黃芪10 g；⑦黨參組：黨參10 g；⑧當(dāng)歸組：當(dāng)歸10 g；⑨白芍組：白芍5 g；⑩桃仁組：桃仁5 g；甘草組：甘草2 g。中藥飲片均由本院中藥房提供。

1.4.3 藥物的制備 參照文獻(xiàn)[5]，中藥用200 mL清水浸泡12 h，武火煮沸，文火煮0.5 h；取出藥液后，再加入200 mL清水，武火煮沸，文火煮0.5 h，取藥液；將2次藥液合并，濃縮至較高濃度。按體積比2：3加入無水乙醇，4 ℃靜置24 h，用無菌濾紙濾去殘渣；再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至無醇味，并進(jìn)一步將各組藥液濃縮至10 mL，調(diào)整pH值為6.8～8.5，均勻倒入培養(yǎng)皿置于-20 ℃預(yù)凍；然后冷凍真空干燥，得到粉末狀物質(zhì)，放入干燥器中備用。根據(jù)既往體外實驗[6-7]結(jié)果，全方組終濃度為4.2 mg/mL時對血小板聚集功能及GP Ib α影響最為顯著，所以各實驗組中藥凍干粉臨用前均稀釋為4.2 mg/mL濃度，經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾除菌后，與血液標(biāo)本共孵育。

1.4.4 中藥干預(yù)靜脈血標(biāo)本 益氣活血方全方及拆方組是在出血性血小板病患者血液標(biāo)本中分別加入10 μL相對應(yīng)的中藥提取物；陰性對照組是在出血性血小板病患者血液標(biāo)本中加入10 μL的0.9%NaCl注射液；正常對照組是在健康獻(xiàn)血員血液標(biāo)本中加入10 μL的0.9%NaCl注射液。將給藥后血液標(biāo)本在37 ℃下孵育30 min。

1.5 觀察指標(biāo)

Real-time PCR法檢測iRhom2 mRNA表達(dá)：按照YBR Green PCR(KAPA Biosystems，貨號KM4101)試劑盒說明書，通過QIAzol Lysis Reagent和氯仿提取總RNA，測定RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，貨號639505)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物名稱及序列如下，iRhom2-F CAAGATGCCCAAGATT，iRhom2-R GGAGTAGCCAGAACGG，在Real-Time System熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)上進(jìn)行擴(kuò)增，共40個循環(huán)，每個樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計算各組靜脈血iRhom2 mRNA的相對表達(dá)水平。

ELISA法檢測GP Ⅴ蛋白表達(dá)：根據(jù)試劑盒說明書，使用人GP Ⅴ ELISA試劑盒(Bioswamp，貨號HM10699)定量檢測各組靜脈血GP Ⅴ蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

陰性對照組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯高于正常對照組，GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P<0.05)。全方組、益氣活血組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組，GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組(P<0.05)；全方組、益氣活血組iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。黃芪當(dāng)歸組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)；GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?；钛MiRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表達(dá)水平比較

3 討論

研究[2-3]表明，出血性血小板病患者發(fā)病過程中，iRhom2可通過與ADAM17前體蛋白結(jié)合，激活iRhom2/ADAM17信號通路，從而促進(jìn)血小板膜表面的GP Ⅴ胞外功能區(qū)過度水解，引起血小板凝血酶受體復(fù)合物活性下降，導(dǎo)致血小板聚集缺陷，引起皮膚、黏膜出血。根據(jù)本病臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“血證”范疇，益氣活血方治療本病療效顯著[1]。本次研究通過體外實驗，觀察了益氣活血方及其拆方對出血性血小板病患者全血iRhom2及GP Ⅴ表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討該方及其組方藥物的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，全方組、益氣活血組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組，GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組；全方組及益氣活血組iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明出血性血小板病患者血液標(biāo)本中的iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表達(dá)在益氣活血全方和益氣活血中藥的干預(yù)下，可恢復(fù)到健康人的水平。

黃芪當(dāng)歸組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組；GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明黃芪-當(dāng)歸藥對可起到一定治療作用?！秲?nèi)外傷辨惑論》卷中記載的當(dāng)歸補(bǔ)血湯，就是由當(dāng)歸與黃芪按一定比例配伍而成，具有補(bǔ)血益氣的功效，用于治療氣血兩虛發(fā)熱證，被稱為“氣血雙補(bǔ)”代表方之一。多項研究[8]表明，黃芪-當(dāng)歸藥對具有同類相須、相輔相成、相互促進(jìn)的功效，對造血系統(tǒng)疾病誘發(fā)的出血、感染、貧血及血小板聚集障礙均有明顯療效。

活血組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組，表明活血藥物可降低出血性血小板病患者血液標(biāo)本中的iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平，佐證中醫(yī)“活血止血，祛瘀生新”治療理論是信而有征的?；钛M藥物由當(dāng)歸、白芍、桃仁3味中藥組成，含有2個中藥藥對配伍。其一為當(dāng)歸芍藥散，最早源自東漢張仲景所著《金匱要略》，該方血水同調(diào)、治血為主，臨床上可用于治療血虛夾瘀之血小板過敏性紫癜、原發(fā)性痛經(jīng)、月經(jīng)過多等疾病[9]；體外實驗[10]提示當(dāng)歸芍藥散含藥血清對血小板聚集有顯著調(diào)節(jié)作用。其二為當(dāng)歸-桃仁藥對，《證治準(zhǔn)繩?類方》載桃仁當(dāng)歸湯具有祛血滯之功效，有學(xué)者[11]基于數(shù)據(jù)挖掘桃仁方劑配伍規(guī)律，發(fā)現(xiàn)桃仁的核心配伍組合之首為當(dāng)歸；體外實驗[12]表明當(dāng)歸-桃仁藥對不同配比對血小板聚集的調(diào)節(jié)作用均大于同等生藥劑量的當(dāng)歸和桃仁單味藥材。

復(fù)方中藥是近年來研究的熱點(diǎn)，其成分復(fù)雜、靶點(diǎn)眾多。目前應(yīng)用的干預(yù)方法主要有3種，包括中藥提取物/純化物直接添加、中藥血清藥理學(xué)及中藥血漿藥理學(xué)。3種添加方法各有利弊，是否選擇了合適的干預(yù)方法直接影響研究結(jié)果的可信度。本文的研究對象是出血性血小板病患者靜脈血標(biāo)本，用實驗動物制作中藥血清、中藥血漿無可行性，故采用中藥粗提取物直接添加。

盡管本研究嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[5]中記載的方法去除雜質(zhì)、調(diào)整酸堿度、制成凍干粉，臨近實驗時再溶解、離心、過濾等，希冀進(jìn)一步減少中藥雜質(zhì)的理化干擾因素。但是由于中藥復(fù)方或單味中藥理化性質(zhì)復(fù)雜，中藥提取物直接添加至血液或細(xì)胞體系中影響因素仍較多。按中藥學(xué)理論，白芍具有“通順血脈，緩中，散惡血，逐賊血”功效，而本實驗結(jié)果顯示白芍組iRhom2 mRNA表達(dá)卻明顯高于陰性對照組，提示該藥不適用于治療出血性血小板病。但是在含有白芍配伍的全方組、益氣活血組及活血組中，能夠明顯降低iRhom2 mRNA表達(dá)。究竟是單味白芍可以導(dǎo)致患者全血iRhom2 mRNA高表達(dá)，還是含有雜質(zhì)的影響因素，或是中藥復(fù)方配伍后，改變了白芍的藥效，目前很難解釋。尚有待更合理的中藥體外研究方法建立，方能解決這類中藥拆方研究中的疑點(diǎn)及難點(diǎn)。

綜上所述，益氣活血方全方及其部分拆方治療出血性血小板病的機(jī)制可能與下調(diào)iRhom2 mRNA表達(dá)及上調(diào)GP Ⅴ蛋白表達(dá)有關(guān)。