鄭亞麗 馮小康 朱 強(qiáng)

(蘇州國環(huán)環(huán)境檢測有限公司，江蘇 蘇州 215000)

草甘膦(glyphosate)，又名農(nóng)達(dá)，是世界上應(yīng)用最多的一種高效、廣譜、低毒的水溶性除草劑，廣泛應(yīng)用于茶園、果園、甘蔗園等系列農(nóng)作物的種植中[1-4]。其在農(nóng)作物中的作用機(jī)理主要是通過抑制植物體內(nèi)5-烯醇丙酮莽草酸-3-膦酸鹽合成酶的活性，干擾植物體內(nèi)莽草酸的合成[5]。該合成酶存在于芳香族氨基酸生物合成中，而且只有在綠色植物中才能產(chǎn)生，因此草甘膦對(duì)綠色植物除草效果明顯。隨著草甘膦使用量的不斷增加，其殘留量嚴(yán)重破壞生態(tài)平衡。多項(xiàng)研究表明，土壤中的草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸能夠通過代謝作用進(jìn)入植物體內(nèi)污染環(huán)境，并通過食物鏈進(jìn)行富集傳遞，影響人類食品安全[6]。因此，對(duì)土壤中草甘膦的殘留狀況進(jìn)行監(jiān)測十分重要，研究建立可靠且能在普通實(shí)驗(yàn)室推廣使用的檢測方法尤為關(guān)鍵。

目前，國內(nèi)外草甘膦的檢測方法主要有氣相色譜法[7]，高效液相色譜法[8]，離子色譜法[9-10]，氣相色譜—質(zhì)譜法[11-13]，液相色譜—質(zhì)譜法[14-15]等。因草甘膦具有易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑，揮發(fā)性低，結(jié)構(gòu)中缺少發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)等特點(diǎn)，常規(guī)方法很難直接檢測[16]。為滿足普通實(shí)驗(yàn)室對(duì)土壤中草甘膦的殘留檢測，高效液相色譜是最適合的分析方法。同時(shí)結(jié)合9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-CL)柱前衍生技術(shù)，以液液萃取凈化土壤中和衍生化產(chǎn)生的雜質(zhì)，用具熒光檢測器的液相色譜進(jìn)行檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備及試劑

Agilent LC 1260，具熒光檢測器 (美國 Agilent 公司)；色譜柱為Infinitylab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×4.6 mm，4 μm，美國Agilent公司)；Milli-pore純水處理裝置(美國Millipore公司)；DT55高速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)； ME204電子天平(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)；KQ-600V 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；THZ-82混勻儀(金壇市科析儀器有限公司)，以及一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 mg/L，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；磷酸(分析純，無錫市晶科化工有限公司)；鹽酸(優(yōu)級(jí)純，昆山金城試劑有限公司)；十水合四硼酸鈉(優(yōu)級(jí)純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；9-芴甲基氯甲酸酯(優(yōu)級(jí)純，Toronto Research Chemicals)；十二水合磷酸鈉(99.99%，阿拉丁)；二水合檸檬酸三鈉(ACS級(jí)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；乙腈、二氯甲烷、正己烷(色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取一定量的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品，純水定容并配制成10.0、20.0、50.0、100、200、500 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2步驟進(jìn)行衍生化實(shí)驗(yàn)后，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析。以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。

1.3 樣品的制備

1.3.1 樣品提取

稱取10 g土壤空白樣品至50 mL離心管中，加入50.0 mL磷酸鈉和檸檬酸鈉混合提取液，超聲提取30 min，8 000 r/min離心5 min，上清液用濾紙過濾，得到提取液。提取液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至9，靜置10 min后用濾紙過濾，加入50 mL正己烷，充分振蕩后靜置，棄去有機(jī)相，水相用50 mL正己烷再萃取一次。

1.3.2 衍生化

取1.00 mL上述凈化后的水溶液于試管中，加入0.12 mL四硼酸鈉溶液和0.20 ml 9-芴甲基氯甲酸酯溶液，密封。常溫下用混勻儀衍生4 h，用針式過濾器過濾后待測。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18 (150 mm×4.6 mm，4 μm)；流動(dòng)相：A(乙腈)，B(0.2%磷酸水溶液)，梯度洗脫程序如表1所示；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：30 μL；熒光條件：激發(fā)波長254 nm，發(fā)射波長315 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

色譜柱的質(zhì)量直接影響到樣品組分的分離情況、組分的定性及定量分析。實(shí)驗(yàn)比較了Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱，ZORBAY ODS柱和ZORBAX Eclipse XDB-C18柱3種液相色譜柱對(duì)草甘膦衍生物的分離效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，草甘膦衍生物在ZORBAY ODS柱和ZORBAX Eclipse XDB-C18柱上分離效果差，響應(yīng)值低，且峰型較寬，有拖尾；而在Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱子上分離效果最好，且峰形尖銳對(duì)稱，色譜圖見圖1。

圖1 不同色譜柱條件下草甘膦衍生物的高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives under different column conditions(A) ZORBAY ODS柱；(B) ZORBAX Eclipse XDB-C18柱；(C) Infinitylab Poroshell 120 EC-C18柱

2.1.2 波長的選擇

不同物質(zhì)在特定波長下的吸收強(qiáng)度不同，吸收強(qiáng)的響應(yīng)值就高，反之，響應(yīng)值小。為了使草甘膦衍生物響應(yīng)值最高，本實(shí)驗(yàn)分別比較了草甘膦衍生物在波長301 nm和315 nm條件下的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖2所示。草甘膦衍生物在波長315 nm條件下峰形良好，響應(yīng)值很高。故，選擇315 nm作為本實(shí)驗(yàn)發(fā)射波長。

圖2 不同波長條件下草甘膦衍生物的高效液相色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives at different wavelengths(A) 301 nm；(B) 315 nm

2.1.3 流速的選擇

流動(dòng)相的流速對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的分離具有一定的影響。分析了流速為0.5 mL/min和1.0 mL/min時(shí)草甘膦衍生物的響應(yīng)情況，結(jié)果顯示在該色譜條件下，流速增大會(huì)使草甘膦衍生物峰型變寬，響應(yīng)強(qiáng)度降低，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇0.5 mL/min作為實(shí)際分析流量。

圖3 不同流速條件下草甘膦衍生物的高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatogram of glyphosate derivatives at different flow rates(A) 0.5 mL/min；(B) 1.0 mL/min

2.2 衍生時(shí)間的優(yōu)化

選取1 mL 0.50 mg/L經(jīng)前處理的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，常溫條件下按照1.3.2條件分別衍生0.5 h、2 h、4 h、6 h和8 h。觀察在相同的實(shí)驗(yàn)條件和檢測條件下，不同衍生時(shí)間對(duì)應(yīng)的樣品測定含量的變化。結(jié)果如圖 4 所示，當(dāng)衍生時(shí)間為4 h時(shí)，草甘膦衍生物含量最大。因此，衍生時(shí)間選擇4 h。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生反應(yīng)的影響Fig. 4 Effects of reaction time onderivatization reaction

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照上述測定草甘膦衍生物的最優(yōu)條件，配制不同質(zhì)量濃度的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L)，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中目標(biāo)化合物濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果(圖5)表明，草甘膦在0.01～0.50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=1.05x+0.381，R2= 0.999 9。

圖5 草甘膦衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve ofglyphosate derivatives

按照樣品分析的全部步驟，對(duì)加標(biāo)含量為0.05 μg/g 的樣品進(jìn)行10次平行測定，根據(jù)10次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算檢出限。

MDL=t(n-1,0.99)×S

式中：MDL——方法檢出限；n——樣品的平行測定次數(shù)；t——自由度為n-1，置信度為99%時(shí)的t分布(單側(cè))；當(dāng)n=10時(shí)，根據(jù)t值表查得t(n-1,0.99)=2.821;S——n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

計(jì)算得出檢出限為0.01 mg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確稱取10 g土壤空白樣品，分別添加0.100、0.500和1.00 mg/kg的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的最佳檢測條件下測定加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，每個(gè)濃度重復(fù)6次?？瞻讟悠返闹苽涑瞬患訕?biāo)，其它步驟同上。結(jié)果如表2所示。

表2 不同添加水平下的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab. 2 Average recovery and relative standard deviation at different addition levels

3 結(jié)束語

本文通過對(duì)濃度為0.100、0.500和1.00 mg/kg的土壤加標(biāo)樣品進(jìn)行6次重復(fù)測定，得出草甘膦的加標(biāo)回收率為80.0%～100%；樣品間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%～7.8%，檢出限0.01 mg/kg，低于方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢出限(0.02 mg/kg)。該方法實(shí)用性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，精密度和準(zhǔn)確度高，檢出限低，非常適用于土壤、地下水、地表水、生活污水、工業(yè)廢水中草甘膦的檢測。