劉志斌 靳 松 牛亦農(nóng)

(1.無錫市第二人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇無錫 214001; 2.清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院泌尿外科，北京 102200; 3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院泌尿外科, 北京 100038)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH)是引起中老年男性排尿功能障礙原因中最常見的一種良性疾病。其主要表現(xiàn)為尿急、尿頻、排尿不暢、終末滴瀝及夜尿增多等下尿路癥狀，后期可逐漸加重為排尿困難、尿潴留等。BPH發(fā)病率隨年齡的增長而增加，60歲男性發(fā)病率為50%，70歲男性發(fā)病率達(dá)80%，85歲以上發(fā)病率達(dá)90%[1-4]。隨著人口老齡化的增加，良性前列腺增生已經(jīng)成為泌尿外科最常見的疾病之一，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。

目前針對前列腺增生的治療包括藥物治療(5α-還原酶抑制劑、α-腎上腺素能受體拮抗劑、中藥制劑以及植物制劑等)和手術(shù)治療(經(jīng)尿道或開放式手術(shù))。對于大多數(shù)有癥狀的BPH男性，藥物治療是首選的初始治療方法。

苯乙基異硫氰酸酯(phenethyl isothiocyanate, PEITC)是植物制劑異硫氰酸酯的一種,廣泛存在于橄欖、花菜等十字花科蔬菜中[5]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤治療中具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[5-6]?，F(xiàn)有研究[7]表明，針對良性前列腺增生的治療中，PEITC可以通過下調(diào)雄激素受體轉(zhuǎn)錄因子sp1的表達(dá)而下調(diào)雄激素受體的表達(dá)，從而抑制大鼠前列腺上皮細(xì)胞的增殖。但對體外培養(yǎng)的良性前列腺上皮細(xì)胞的作用還未見相關(guān)報道。X染色體連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中的典型成員，可通過抑制啟動Caspase-9,從而抑制其效應(yīng)蛋白Caspase-3和Caspase-7,最終抑制細(xì)胞凋亡[8]。

PEITC作為潛在的治療前列腺增生的植物制劑，能否對前列腺上皮細(xì)胞的存活產(chǎn)生影響，能否成為有效的治療藥物尚需進(jìn)一步研究。本研究采用PEITC作用于前列腺上皮細(xì)胞(benign prostatic hyperplasia cell line,BPH-1),觀察PEITC對BPH-1細(xì)胞增殖、凋亡與自噬的影響；檢測XIAP mRNA及其蛋白表達(dá)，以及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，初步探討PEITC對前列腺上皮細(xì)胞增殖凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人永生化良性前列腺上皮細(xì)胞(BPH-1)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。PEITC(純度≥98%)由無錫杰西醫(yī)藥科技有限公司贈送。 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購買于美國Invitrogen 公司。PEITC使用前用DMSO稀釋，同時將等體積的DMSO(最終質(zhì)量濃度<0.1%)添加到對照組中。細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和青霉素/鏈霉素抗生素混合物，均購自澳洲Gibco公司。CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒購自日本株式會社同仁化學(xué)研究所。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國南京凱基生物科技公司。XIAP-Atg 5-12和β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。Fast Quant RT試劑盒和Talent qPCR PreMix(SYBR Green)購自北京天根生物科技公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及活性檢測

BPH-1細(xì)胞用含有10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù)) CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔1 000個細(xì)胞，加入培養(yǎng)基200 μL。37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。更換細(xì)胞培養(yǎng)基，分別向96孔板中加入終濃度為6、12、24 μmol/L的PEITC作為實驗組，對照組加入等體積的DMSO，分別作用6、12、24、36 h。孵育結(jié)束后，每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，充分混勻，繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度，并計算細(xì)胞活性。細(xì)胞存活率=(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)。

1.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

取對數(shù)期生長的BPH-1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔5×106個細(xì)胞，加入培養(yǎng)基2 mL。37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁。分別向6孔板中加入終濃度為6、12、24 μmol/L的PEITC作為實驗組，對照組加入等體積的DMSO，繼續(xù)孵育24 h。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2次，用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化后1 200 r/min 離心，棄上清，制備單細(xì)胞懸濁液。細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞密度計算，計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至106個/mL。取1 mL懸濁液，1 200 r/min離心5 min，棄上清。加入400 μL Binding Buffer 及5 μL Annexin-V/FITC 輕混勻，避光冰上放置15 min。加入10 μL PI后輕混勻，避光冰上放置5 min。流式上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4 Western blotting法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

取對數(shù)期生長的BPH-1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，方法同上，附壁過夜培養(yǎng)24 h。分別向6孔板中加入終濃度為6、12、24 μmol/L的PEITC作為實驗組，對照組加入等體積的DMSO，繼續(xù)孵育24 h。預(yù)冷的PBS 3 μL清洗細(xì)胞3次，加入含有苯甲基磺酰氟的RIPA細(xì)胞裂解液400 μL后置于冰上30 min，充分裂解，取樣本置于1.5 mL離心管中。渦旋震蕩充分混勻，于4 ℃預(yù)冷的離心機(jī)內(nèi)，12 000 r/min離心5 min。取上清液即細(xì)胞全蛋白。BCA法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度。制備10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的SDS-PAGE分離膠及聚集膠。配平后，分別加樣Loading Buffer及蛋白共10 μL，80 V恒壓電泳。400 mA恒流電轉(zhuǎn)90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。脫脂牛奶封閉抗原30 min,TBST清洗3次，每次10 min。XIAP抗體，Atg5-12 抗體1∶1 000稀釋，β-actin 抗體1∶1 500稀釋。4 ℃孵育抗體過夜，TBST洗脫3次，孵育二抗2 h。Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)曝光，軟件Image J V 4.0計算蛋白表達(dá)。

1.5 Real-time PCR 檢測BPH-1細(xì)胞XIAP mRNA表達(dá)

按照如上方式培養(yǎng)BPH-1細(xì)胞24 h,采用TRIzol-異丙醇-氯仿-乙醇三步法進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取。測定RNA濃度，用QuantScript Kit將1mg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 然后按照Talent熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)，25 μL反應(yīng)體系配比各試劑。RT-PCR反應(yīng)引物及體系如下:XIAP反應(yīng)引物為：Forward：5′-TACCGTGCGGTGCTTTAGTT-3′；Reverse：5′-TTTGTAGACTGCGTGGCACT-3′；GAPDH反應(yīng)引物為：Forward：5′-GAAGGTGAAGGTCGGATGC-3′；Reverse：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；反應(yīng)體系：預(yù)變性：95 ℃，15 min；變性：95 ℃、10 s；退火：57 ℃、30 s；延伸：72 ℃、30 s，40個循環(huán)。所得數(shù)據(jù)與內(nèi)參GAPDH之比作為相對值，通過公式2-ΔΔCt計算得到目的基因的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PEITC對BPH-1細(xì)胞增殖的影響

BPH-1細(xì)胞經(jīng)過6、12、24 μmol/L PEITC 處理6 h后，細(xì)胞相對活性分別為71.22%、48.90%、13.57%；處理12 h后細(xì)胞相對活性分別為52.57%、42.37%、10.11%；處理24 h后細(xì)胞相對活性分別為36.73%、25.88%、8.39%；處理36 h后，細(xì)胞相對活性分別為33.57%、25.83%、13.06%(圖1)。細(xì)胞相對活性呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。

2.2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測PEITC對于BPH-1細(xì)胞凋亡的影響

Annexin-V/PI 染色結(jié)果如下圖所示(圖2A)。BPH-1細(xì)胞經(jīng)過6、12、24 μmol/L PEITC處理24 h后，細(xì)胞總凋亡率分別為19.5%、30.4%、40.1% (圖2B)，與對照組相比，12、24 μmol/L處理組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 PEITC處理的BPH-1細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptosis of BPH-1 cells treated with PEITCA: PEITC promoted apoptosis of BPH-1 cells; B: PEITC promoted early apoptosis of BPH-1 cells in a concentration-dependent; *P<0.05 vs control. Early apoptosis: Annexin V+/PI-; Late apoptosis: Annexin V+/PI+; PEITC： phenethyl isothiocyanate； BPH-1: benign prostatic hyperplasia cell line.

2.3 PEITC下調(diào)XIAP蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，BPH-1細(xì)胞經(jīng)過6、12、24 μmol/L PEITC 處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)XIAP蛋白表達(dá)量較對照組下降(圖3)。

圖3 PEITC對BPH-1細(xì)胞中XIAP表達(dá)的影響Fig.3 The effects of PEITC on the expression of XIAP in BPH-1 cells PEITC suppressed the expression of XIAP in BPH-1 cells in a concentration-dependent way. β-Actin was used as a loading control; PEITC: phenethyl isothiocyanate; BPH-1: benign prostatic hyperplasia cell line; XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis.

2.4 PEITC下調(diào)XIAP mRNA的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，BPH-1細(xì)胞經(jīng)過6、12、24 μmol/L PEITC處理24 h后，XIAP mRNA相對表達(dá)量較對照組分別下調(diào)了1.212倍、1.37倍、2.918倍。與對照組相比，12、24 μmol/L處理組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4 PEITC對BPH-1細(xì)胞中XIAP mRNA表達(dá)的影響Fig.4 The effects of PEITC on the expression of XIAP mRNA in BPH-1 Cells Suppressed transcription of XIAP mRNA was detected with real-time PCR in BPH-1 cells treated with PEITC. The level of mRNA was normalized to the value of the β-actin housekeeping gene mRNA.*P<0.05 vs control; PEITC: phenethyl isothiocyanate;BPH-1: benign prostatic hyperplasia cell line; XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis.

2.5 PEITC下調(diào)Atg5-12 蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，BPH-1細(xì)胞經(jīng)過6、12、24 μmol/L PEITC 處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)XIAP蛋白表達(dá)量較對照組下降(圖5)。

圖5 PEITC對BPH-1細(xì)胞中Atg5-12表達(dá)的影響Fig.5 The effects of PEITC on the expression of Atg 5-12 in BPH-1 cells PEITC suppressed the expression of Atg5-12 protein in a concentration-dependent way in BPH-1 cells.β-Actin was used as a loading control. PEITC: phenethyl isothiocyanate; BPH-1: benign prostatic hyperplasia cell line.

3 討論

前列腺的正常大小有賴于腺體內(nèi)細(xì)胞增殖與程序性死亡的平衡,細(xì)胞的過度增殖和程序性死亡的減少均可導(dǎo)致前列腺體積的增大[9]。細(xì)胞程序性死亡是多細(xì)胞有機(jī)體為了調(diào)控機(jī)體發(fā)育,維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞主動死亡過程。在正常組織中,細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞死亡速率間保持平衡狀態(tài)。一旦平衡失調(diào),無論是細(xì)胞復(fù)制速率增加還是細(xì)胞程序性死亡速率減少,都將導(dǎo)致前列腺增生[10]。

本研究前期實驗顯示，不同濃度的PEITC處理細(xì)胞時，在相同的處理時間內(nèi)，隨著藥物濃度的增加,BPH-1細(xì)胞相對存活率下降。在同等濃度作用下，隨著藥物作用時間的增加，細(xì)胞的相對存活率也逐漸下降，并在作用24 h后，細(xì)胞的相對活性下降至50%以下。同時本研究顯示，作用36 h后細(xì)胞的相對活性相比于作用24 h后不再下降，說明PEITC在作用24 h后可以達(dá)到最大的抑制效果。因此在后續(xù)實驗中，筆者選擇不同濃度的PEITC作用BPH-1細(xì)胞24 h觀察實驗結(jié)果。

本研究顯示,隨著PEITC濃度的增加，細(xì)胞總凋亡率及早期凋亡率也逐漸增加。說明PEITC可誘導(dǎo)BPH-1細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。

細(xì)胞程序性死亡包括細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的特殊程序性死亡之一，目前研究[11-12]表明,細(xì)胞凋亡主要有死亡受體途徑和線粒體途徑。無論哪種途徑，細(xì)胞凋亡信號最終需要Caspase酶的激活而執(zhí)行。目前已發(fā)現(xiàn)的Caspase有11種，分為兩類，一部分是以Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-10為代表的凋亡起始相關(guān)蛋白，一部分是以Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7為代表的凋亡執(zhí)行蛋白。其中Caspase-9作為重要的啟動因子，發(fā)揮重要的作用[11, 13]。Caspase-9與Apaf-1(apoptotic protease activating factor-1)結(jié)合為復(fù)合物而激活，然后激活下游的效應(yīng)分子Caspase-3產(chǎn)生凋亡級聯(lián)反應(yīng)而引起凋亡的發(fā)生[14]。XIAP可競爭性與Apaf-1結(jié)合，通過抑制Caspase-9-Apaf-1復(fù)合體的產(chǎn)生而抑制細(xì)胞凋亡[15]。Sakao等[16]報道，在前列腺癌細(xì)胞中，PEITC可以通過下調(diào)XIAP蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，PEITC作用于BPH-1細(xì)胞24 h后，隨著PEITC濃度的增加，XIAP的表達(dá)量逐漸下降。同樣地，Real-time PCR結(jié)果表明，隨著PEITC作用濃度的增加，XIAP mRNA表達(dá)量逐漸下調(diào)。說明PEITC通過下調(diào)BPH-1中XIAP mRNA的表達(dá)來降低XIAP蛋白表達(dá),并呈現(xiàn)出劑量依賴性，從而促進(jìn)了BPH-1細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞的程序性死亡除了凋亡還包括自噬。自噬是面對外界環(huán)境刺激而自發(fā)程序性出現(xiàn)的細(xì)胞分解代謝過程，其通過自噬溶酶體途徑來維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[17-18]。自噬過程受到一系列自噬相關(guān)蛋白的調(diào)控，研究[19-20]顯示，自噬相關(guān)蛋白Atg5在自噬形成過程中必不可少。Atg5泛素化修飾Atg12后，與其形成Atg5-12復(fù)合體，促進(jìn)自噬囊泡的形成，后者是自噬發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng)。研究[21]結(jié)果表明，誘導(dǎo)Atg 5的表達(dá)可以促進(jìn)自噬的發(fā)生。Bommareddy等[22]報道了在前列腺癌細(xì)胞中，PEITC可以通過上調(diào)Atg5蛋白表達(dá)從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及凋亡。隨后筆者檢測了BPH-1細(xì)胞在不同濃度PEITC作用下Atg5蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，隨著PEITC濃度的增加，Atg5蛋白表達(dá)量逐漸下降。結(jié)果恰恰與在前列腺癌細(xì)胞中的作用相反，PEITC處理后BPH-1細(xì)胞自噬的過程受到了抑制。目前對于細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)性還沒有統(tǒng)一的觀點。有學(xué)者[23-24]提出,細(xì)胞凋亡和自噬是相互抑制的。例如在淋巴細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，通過抑制細(xì)胞自噬過程可提高細(xì)胞凋亡的比例[23]。也有研究[24]結(jié)果表明，在肝癌細(xì)胞中，用Atg5 siRNA干擾后，細(xì)胞自噬作用受到顯著抑制，同時細(xì)胞凋亡比例顯著增加。本研究結(jié)果與此相一致，PEITC通過下調(diào)Atg 5 蛋白的表達(dá)而抑制BPH-1細(xì)胞自噬的發(fā)生，可能由此促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，PEITC 抑制前列腺上皮細(xì)胞增殖，通過下調(diào) BPH-1中XIAP mRNA降低XIAP蛋白表達(dá)，促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞的凋亡并呈現(xiàn)出劑量依賴性；同時PEITC下調(diào)了自噬相關(guān)蛋白Atg-5；PEITC對凋亡與自噬的調(diào)節(jié)可能存在相關(guān)性。