呂瑞瑞，楊成聰，李偉程，趙飛燕，馬 騰，孫志宏，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實驗室內(nèi)蒙古乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實驗室 呼和浩特010018）

奶酪是一種具有悠久歷史的發(fā)酵乳制品，常被稱為干酪或奶豆腐，因營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特而廣受人們的喜愛。奶酪通常是由動物乳發(fā)酵后，排出乳清再經(jīng)成熟得到的一種發(fā)酵乳制品[1]，其含有豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)及維生素等成分，具有很高的營養(yǎng)價值[2]，可以預(yù)防齲齒和降低慢性疾病的發(fā)生[3-4]。

奶酪中含有豐富的微生物資源，其中乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）對于改善奶酪感官品質(zhì)及風(fēng)味具有重要作用[5]。LAB 是一類可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌總稱[6]，在發(fā)酵過程中可促進(jìn)奶酪成熟，提高營養(yǎng)價值及強(qiáng)化風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[7]，在改善奶酪質(zhì)地、拉伸性、氣孔形成和抑制病原微生物生長等方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。攝入一定量的LAB 可改善人體腸道菌群，提高人體免疫力，抗腫瘤，降低血液膽固醇及血壓[10]，并且奶酪中的乳酸菌及其代謝產(chǎn)物可在一定程度防止便秘和腹瀉，有利于人體健康[11]。因此發(fā)掘奶酪中LAB 的物種多樣性有利于乳酸菌資源開發(fā)。

第三代測序技術(shù)具有超長讀長、測序時間短、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可在種水平對樣品中的微生物進(jìn)行分析[12]。LAB 作為發(fā)酵食品中最主要的一類細(xì)菌，在多種發(fā)酵食品中均有參與。本研究對14 份奶酪樣品進(jìn)行乳酸菌特異性測序和后續(xù)生物信息學(xué)分析，探究不同地區(qū)奶酪中LAB 的物種多樣性，為挖掘乳酸菌資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品收集 14 份奶酪樣品采自不同地區(qū)，其中12 份與Yang 等[13]所研究的奶酪樣品相同?，F(xiàn)將樣品命名為CA1～CA14，具體信息見表1。將采集的奶酪樣品速凍后，迅速運(yùn)輸至內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實驗室-80℃保藏備用。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

全自動高壓蒸汽滅菌器，日本三洋公司；HWS24 型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5810R 高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；Applied Biosystems PCR 儀，美國Applied Biosystems 系統(tǒng)公司；微量紫外分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific 公司；CDS8000 型UPV 凝膠成像分析系統(tǒng)，上海賽智創(chuàng)業(yè)科學(xué)公司；Qubit 2.0 核酸蛋白定量儀，美國Life Technologies 公司；SMRT RS II 測序平臺，美國Pacific Biosciences公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取方法 取0.5 g 奶酪樣品充分研磨，采用試劑盒按照說明書提取奶酪樣品宏基因組DNA，隨后檢測DNA的片段完整度、純度及濃度，將符合要求的宏基因組DNA 貯存到-80 ℃冰箱進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2.2 乳酸菌目的片段擴(kuò)增、建庫及測序 本文參照徐海燕等[14]研究中乳酸菌引物、建庫及測序方法進(jìn)行試驗。乳酸菌引物（表2）兩端添加Barcode 用于區(qū)別同一文庫中不同樣品。PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，60℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)28 次；72 ℃終端延伸7 min，4 ℃終止。各樣品PCR 產(chǎn)物純化后，用PacBio SMRT RS II 測序平臺配套試劑盒構(gòu)建文庫，根據(jù)說明書進(jìn)行后續(xù)試驗操作。

表2 乳酸菌特異性引物Table 2 The specific primers of lactic acid bacteria

1.2.4 生物信息學(xué)分析 下機(jī)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)處理具體分析流程參考Yang 等[13]的方法。其中乳酸菌注釋使用Greengenes（v13.8）、RDP（v11.5）和Silva（v128）3 個數(shù)據(jù)庫對分類地位進(jìn)行確定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用香農(nóng)曲線（Shannon index curve）和稀疏曲線（Observed species curve）評估每個樣本測序的多樣性，并判斷當(dāng)前測序量是否能夠滿足后續(xù)生信分析的需要。計算α 多樣性指標(biāo)，其中包括香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)（Observed species）、超1 指數(shù)（Chao1 index）和辛普森指數(shù)（Simpson index）?；赨nifrac 距離對14 份奶酪樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principal coordinate analysis，PCoA），利用Venn 圖在OTU 水平上分析不同分組間OTU 組成差異。采用Lefse 分析（Linear discriminant analysis effect size）比較差異菌種。用斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)系數(shù)分析樣品中乳酸菌菌種的相關(guān)關(guān)系并進(jìn)行顯著性檢驗，檢驗水平為95%。不同地區(qū)14 份奶酪樣品測序數(shù)據(jù)已上傳至SRA 數(shù)據(jù)庫（PRJNA643871）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌測序豐度及多樣性

為評估測序深度是否覆蓋了全部樣品的絕大部分乳酸菌，繪制稀疏曲線（圖1a）和香農(nóng)曲線（圖1b）。結(jié)果顯示，稀疏曲線雖未達(dá)到最終狀態(tài)，但有趨于平緩的趨勢，香農(nóng)曲線顯示全部樣品進(jìn)入或接近平臺期，由此可見，當(dāng)前測序量可滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

圖1 稀疏曲線（a）和香農(nóng)曲線（b）Fig.1 Observed species curve（a）and Shannon index curve（b）

14 份奶酪樣品的序列信息和α 多樣性指數(shù)如表3所示，在物種豐度上，采自西班牙地區(qū)的CA6 樣品Chao1 指數(shù)最大，乳酸菌物種數(shù)最豐富；而采自意大利地區(qū)的樣品CA7 Chao1 指數(shù)最小，乳酸菌物種數(shù)最少。在物種多樣性上，采自西班牙地區(qū)的CA6 和中國西藏自治區(qū)的CA14 樣品對應(yīng)的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)最高，說明物種多樣性程度最高；而意大利地區(qū)的CA7 香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)均最小，反映出二者物種多樣性程度最低。

表3 樣品的測序序列信息和α 多樣性指數(shù)Table 3 Sequence abundances and α-diversity in all samples

2.2 奶酪中乳酸菌組成分析

在屬水平上，14 份奶酪樣品中乳酸菌菌群構(gòu)成如圖2所示，14 份奶酪樣品共鑒定到14 個乳酸菌屬，其中平均相對含量大于1.0%有4 個菌屬，分別是乳桿菌屬（Lactobacillus，30.28%）、乳球菌屬（Lactococcus，28.31%）、鏈球菌屬（Streptococcus，24.75%）和葡萄球菌屬（Staphylococcus，15.16%），檢出率全部為100%（14/14）。平均相對含量大于0.1%且小于1.0%有4 個菌屬，分別為腸球菌屬（Enterococcus，0.68%）、片球菌屬（Pediococcus，0.36%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，0.17%）、魏斯氏菌屬（Weissella，0.14%），其中除魏斯氏菌屬檢出率為57%（8/14），其余3 個菌屬檢出率均小于50%。

圖2 奶酪在屬水平的乳酸菌菌群構(gòu)成Fig.2 Genus-level composition of LAB in the cheese

Yang 等[13]使用細(xì)菌通用16S rRNA 引物27F/1495R 與PacBio SMRT 測序技術(shù)相結(jié)合對其中12 份樣品進(jìn)行分析，檢測到的優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、葡萄球菌屬和明串珠菌屬三代測序技術(shù)結(jié)合細(xì)菌通用引物27F/1492R 一般情況下捕獲乳酸菌序列占總序列數(shù)不到3%[14]。本研究中采用PacBio SMRT 三代測序與乳酸菌特異性引物相結(jié)合的方法還鑒定到腸球菌屬、片球菌屬和魏斯氏菌屬。趙順先等[15]采用Illumina 高通量測序技術(shù)對新疆干酪中乳酸菌多樣性和環(huán)境關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬是優(yōu)勢菌屬，奶酪營養(yǎng)成分也會對其中的乳酸菌菌群組成造成影響。段宇珩等[16]從青海曲拉中檢測到的優(yōu)勢菌屬為明串珠菌屬、腸球菌屬和乳桿菌屬。上述相同菌屬作為奶酪中的常見乳酸菌菌屬，然而在不同地區(qū)樣品中的優(yōu)勢菌種會存在顯著差異[17]。由于奶酪發(fā)酵中無外源發(fā)酵劑的添加，產(chǎn)生這種情況的原因可能是采樣地區(qū)，氣候、環(huán)境及制作方式等多種因素對奶酪中乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

在種水平上，所有奶酪樣品共發(fā)現(xiàn)65 個乳酸菌種，其中平均相對含量大于1%的有12 個菌種，主要包括乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，27.10% ）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，14.35%）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，9.92%）、馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum，8.93%）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis，7.29% ），鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，7.15%）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii，5.10%）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus，4.02%）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，2.01% ）、副乳房鏈球菌（Streptococcus parauberis，1.95%）、雞乳桿菌（Lactobacillus gallinarum，1.24%）和Lactobacilluskisonensis（1.05%）。

其中，乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、馬胃葡萄球菌和腐生葡萄球菌檢出率為100%（14/14）。其中在CA6、CA9、CA10、CA12 和CA13 中乳酸乳球菌相對含量最高，在CA3 和CA1 中嗜熱鏈球菌相對含量最高。在CA4 和CA14 中檢測到相對含量較高的馬胃葡萄球菌和腐生葡萄球菌。只在CA2 中檢測到相對含量較高的副乳房鏈球菌和Lactobacillus kisonensis。德氏乳桿菌檢出率為93%（13/14）。雞乳桿菌檢出率為78%（11/14）。副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌檢出率為71%（10/14）。不同樣品的乳酸菌組成及其相對含量差異較大。乳房鏈球菌和副干酪乳桿菌平均相對含量分別7.29%和1.95%，但二者檢出率均為36%（5/14），值得注意的是乳房鏈球菌在CA8 平均相對含量為98.22%，副乳房鏈球菌在CA2 中平均相對含量為26.27%。僅在西藏樣品CA14 中檢測相對含量較高的馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens），該菌常在西藏自然發(fā)酵乳制品中檢出。劉飛翔等[18]發(fā)現(xiàn)可做益生菌的微生物有乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、屎腸球菌。然而屎腸球菌僅在CA6 中檢出，腸膜明串珠菌僅在CA6 和CA14 中檢出。乳酸乳球菌和腸膜明串珠菌的協(xié)同作用會使乳制品香氣更濃烈[19]。在工廠生產(chǎn)中，適當(dāng)添加腸膜明串珠菌作為輔助發(fā)酵劑，明顯縮短發(fā)酵周期且改善產(chǎn)品風(fēng)味[13]。

圖3 奶酪乳酸菌在種水平的組成Fig.3 Species-level composition of LAB in the cheese

2.3 乳酸菌群落結(jié)構(gòu)分析

為探究不同樣品中乳酸菌結(jié)構(gòu)的組成差異，基于非加權(quán)的Unifrac 距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析（圖4a），樣品CA10、CA12 和CA13 物種組成可能較為相似，故聚為一簇，然而其它樣品之間并沒有顯著聚類，這可能由于乳酸菌菌種組成差異較大所致。在基于加權(quán)的Unifrac 距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析圖中（圖4b），奶酪樣品呈現(xiàn)明顯趨勢聚為3 組，然而3 組之間乳酸菌多樣性存在較大差異，每組樣品乳酸菌群落結(jié)構(gòu)更為相似。根據(jù)乳酸菌群落組成及豐度，將14 份奶酪分為3 組，第1 組包含CA6、CA9、CA10、CA12 和CA13，第2 組包含CA1、CA2、CA3 和CA8，第3 組包含CA4、CA5、CA7、CA11 和CA14，各類型代表性菌屬分別為乳球菌屬、鏈球菌屬和乳桿菌屬，然而第3 組樣品中CA4 和CA14 的絕對優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌屬，相對含量分別為83.04%和66.26%。

根據(jù)不同分組進(jìn)行屬水平LEfSe 分析（圖4c和4d）發(fā)現(xiàn)，乳球菌屬在第1 組中顯著富集，鏈球菌屬在第2 組中豐度更高，然而圖中第3 組并未發(fā)現(xiàn)顯著差異的菌種，該結(jié)果與PCoA 結(jié)果基本一致；在種水平進(jìn)行LEfSe 分析，僅在第1 組中發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌含量顯著高于其它類型。

圖4 奶酪乳酸菌菌群多樣性分析Fig.4 Diversity analysis of lactic acid bacteria in cheese

在奶酪的3 組樣品中，第1 組CA6 和CA13采自西班牙，其它分別采自意大利、法國和希臘，以上地區(qū)氣候類型全部屬于地中海氣候，表明地理位置和環(huán)境會對奶酪中乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)及豐度產(chǎn)生影響。第2 組中CA1、CA3 和CA8 分別采自荷蘭、德國和意大利，以上3 個地區(qū)臨?？諝鉂穸却?、冬溫夏涼；第3 組中CA7 和CA11 采自意大利，其余分別采自法國、瑞士和中國西藏自治區(qū)。除中國西藏自治區(qū)外，其余3 個國家毗鄰，研究發(fā)現(xiàn)海拔、空氣濕度、培養(yǎng)和生產(chǎn)技術(shù)也會影響奶酪微生物菌群結(jié)構(gòu)[13]。值得注意的是CA7、CA8、CA9和CA11 均采自意大利，但并沒有顯著聚類，這可能是由于同一地區(qū)，不同的原料、生產(chǎn)環(huán)境、制作手法及發(fā)酵方式也會對奶酪的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。趙順先等[15]研究發(fā)現(xiàn)制作工藝、生產(chǎn)溫度及奶源本身微生物的差異，可能導(dǎo)致自然發(fā)酵奶酪樣品細(xì)菌群落組成產(chǎn)生差異。

奶酪樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)會因采樣地區(qū)、地理環(huán)境和樣品制作手法的不同而有所差異[20]。Venn 圖可反映不同組之間共有和獨(dú)有物種情況，本研究利用Venn 圖對各組樣品中乳酸菌在OTU水平上進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示各組之間乳酸菌差異比較明顯。在OTU 水平上（圖5），14 份樣品共有646 個OTU，其中每組特有OTU 分別為179，112 和171 種，核心OTU 為86 種，相對含量占總OTU 數(shù)目的13.3%。由圖可知，不同地區(qū)的奶酪樣品，因氣候、地理環(huán)境等影響會形成其特有OTU，Dugat-Bony 等[21]發(fā)現(xiàn)采樣地不同，干酪中乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較大差異。Kamimura 等[22]研究表明不同地區(qū)的樣品會因生產(chǎn)環(huán)境的不同而導(dǎo)致細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)會有顯著的差異。

圖5 不同地區(qū)樣品在OTU 水平下乳酸菌物種的Venn 圖Fig.5 Venn figure of LAB OUT of all cheese samples from different region

微生物互作在發(fā)酵食品中發(fā)揮著重要作用，通過代謝營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸和其它代謝物，對其它細(xì)菌產(chǎn)生抑制、促進(jìn)等作用[23]。為揭示奶酪中乳酸菌之間的相關(guān)關(guān)系，對每組樣品中平均相對含量大于1%的核心菌群進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和副乳房鏈球菌、雞乳桿菌、德氏乳桿菌呈顯著正相關(guān)（r=0.62，r=0.54，r=0.55；P<0.05），德氏乳桿菌和雞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌呈顯著正相關(guān)（r=0.56，r=0.54；P<0.05），腐生葡萄球菌和馬胃葡萄球菌呈顯著正相關(guān)（r=0.66；P<0.01）；雞乳桿菌和乳酸乳球菌呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.55；P<0.05）。有研究表明乳桿菌產(chǎn)酸較快，且其酸耐受能力較乳球菌強(qiáng)，在發(fā)酵過程產(chǎn)酸會對部分乳球菌產(chǎn)生抑制作用，且乳酸乳球菌會產(chǎn)生對革蘭氏陽性細(xì)菌有抑制作用的尼生素[24-25]，這可能會導(dǎo)致雞乳桿菌和乳酸乳球菌呈顯著負(fù)相關(guān)。在奶酪發(fā)酵過程中，發(fā)酵劑乳酸菌菌群（如德氏乳桿菌）可為非發(fā)酵劑菌群（如植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）提供重要的代謝前體物和適宜的生長環(huán)境[26]，該結(jié)論與本研究發(fā)現(xiàn)具有一致性。

圖6 奶酪中乳酸菌的相關(guān)性Fig.6 Spearman’s rank correlation of LAB in the cheese

3 結(jié)論

本研究采用乳酸菌特異性引物與PacBio SMRT 測序技術(shù)相結(jié)合的方法，對14 份不同地區(qū)的奶酪樣品進(jìn)行乳酸菌的物種多樣性分析，共鑒定到14 個乳酸菌屬，65 個乳酸菌種。由于地理環(huán)境、生產(chǎn)方式及原料等因素影響，不同地區(qū)的奶酪樣品其乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)會存在顯著差異，且奶酪中部分低豐度乳酸菌間互作作用有利于奶酪成熟及貯藏。奶酪作為益生乳酸菌分離重要來源，通過研究乳酸菌多樣性及相關(guān)性分析可為今后挖掘有商業(yè)價值的乳酸菌、乳酸菌益生特性開發(fā)和改良新型奶酪提供一定的理論基礎(chǔ)。