馬曉文 ，李發(fā)弟 ，2，李飛 *，郭龍

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020；2.甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅民勤733300）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）是包括共軛雙鍵的十八碳二烯酸同分異構(gòu)體組成的混合物［1］。諸多學(xué)者研究表明，CLA 具有抗癌［2］、抗糖尿?。?］、抗高血壓［4］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［5］、提高機(jī)體免疫機(jī)能和改變脂代謝［6］等眾多優(yōu)點(diǎn)。人類攝入的CLA 主要來源于反芻動(dòng)物的肉和乳。CLA 可通過十八碳二烯酸經(jīng)反芻動(dòng)物瘤胃微生物溶纖維丁酸弧菌生物加氫合成［7］。Martin 等［8］和 Kalscheur 等［9］在體外（in vitro）和體內(nèi)（in vivo）研究均發(fā)現(xiàn)低的瘤胃pH 值會(huì)導(dǎo)致瘤胃微生物區(qū)系發(fā)生改變進(jìn)而降低多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的生物加氫過程。同時(shí)，瘤胃中一些微生物數(shù)量發(fā)生改變，尤其是對(duì)pH 較敏感的纖維分解菌，隨著瘤胃pH 降低，瘤胃纖維分解菌如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量會(huì)快速減少［10］。而瘤胃pH 值主要受飼糧中瘤胃可降解淀粉含量的影響，進(jìn)而影響瘤胃中的生物氫化［11］及肌肉脂肪酸的含量。大麥（Hordeum vulgare）作為一種常見的谷物來源，其在瘤胃中的降解速率高于玉米（Zea mays），但降解過快會(huì)改變瘤胃微生物區(qū)系，甚至造成瘤胃酸中毒等健康問題，而谷物加工處理方式能夠影響谷物淀粉在瘤胃的降解率［12］，進(jìn)而改變瘤胃微生物區(qū)系以及肌肉脂肪酸的合成。因此，本試驗(yàn)通過將大麥進(jìn)行不同粒度的粉碎，改變瘤胃可降解淀粉的含量，探究大麥不同粉碎粒度對(duì)瘤胃微生物區(qū)系組成及其肌肉脂肪酸含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼糧

參照我國農(nóng)業(yè)行業(yè)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816-2004）［13］，試驗(yàn)飼糧配制能夠滿足（30.00±0.20）kg，平均日增重250 g 斷奶湖羊的營養(yǎng)需要。飼糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)成分Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物

于2019 年5-9 月，在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院民勤試驗(yàn)基地開展試驗(yàn)。選用54 只平均體重為（29.70±1.70）kg 的斷奶湖羊公羔，隨機(jī)分為3 個(gè)處理，每個(gè)處理18 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 只羊。大麥分別經(jīng)過2、3 和4 mm篩片粉碎，然后與其他飼料原料混勻后制成全混合顆粒飼糧。整個(gè)試驗(yàn)期包括：預(yù)飼期7 d，正試期63 d 和采樣期1 d。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開始前，對(duì)羊舍和試驗(yàn)場(chǎng)地進(jìn)行嚴(yán)格清潔和消毒，試驗(yàn)羊按照免疫程序嚴(yán)格注射疫苗、驅(qū)蟲及布病檢測(cè)。所有羊進(jìn)行單欄飼養(yǎng)，于每日08：00 和18：00 飼喂，自由采食和飲水，定期消毒和清潔衛(wèi)生。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.4.1 血液指標(biāo)的測(cè)定 正試期結(jié)束后，每組隨機(jī)選擇10 只體況相近的羊，晨飼前在頸靜脈處，用采血針采集全血置于2 mL 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，上下輕微顛倒，使抗凝劑與血液充分混勻，防止凝固，在2 h 內(nèi)完成血常規(guī)分析。參考周文靜［15］的方法，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（IDEXX，ProCyte DX，USA）測(cè)定血液中的紅細(xì)胞總數(shù)（red blood cells，RBC）、血紅蛋白濃度（hemoglobin concentration，HGB）、紅細(xì)胞壓積（hematocrit，HCT）、平均血小板體積（mean platelet volume，MPV）、血小板總數(shù)（platelets，PLT）、白細(xì)胞總數(shù)（white blood cells，WBC）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（lymphocyte，LYMPH）、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（monocyte，MONO）、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（eosinophil，EO）、嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（neutrophil，NEUT）、嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（basophil，BASO）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（mean red blood cell hemoglobin concentration，MCHC）、平均紅細(xì)胞體積（mean red blood cell volume，MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean red blood cell hemoglobin content，MCH）、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation of red blood cell distribution width，RDW-SD）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（coefficient of variation of red blood cell distribution width，RDW-CV）等血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)動(dòng)物機(jī)體健康狀態(tài)。

1.4.2 瘤胃微生物DNA 的提取和分析 在正試期結(jié)束后，每組隨機(jī)選取10 只羊在晨飼后3 h 進(jìn)行屠宰，屠宰后采集瘤胃內(nèi)容物于50 mL 凍存管中，立即置于液氮中進(jìn)行速凍，后置于-80 ℃冰箱保存用于瘤胃微生物DNA的提取分析。參照試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，佐治亞州，美國）的說明書進(jìn)行瘤胃內(nèi)容物微生物DNA 的提取，通過熒光定量儀（Bio-Rad Laboratories，赫拉克勒斯，美國）對(duì)普雷沃氏菌、反芻獸新月形單胞菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、溶纖維丁酸弧菌和總菌進(jìn)行熒光定量分析。反應(yīng)在96 孔熒光定量板中進(jìn)行，反應(yīng)體系為 20 μL，其中包括：10 μL SYBR Green Ⅱ，7.8 μL ddH2O，0.6 μL 上下游引物和 1 μL 瘤胃微生物DNA。擴(kuò)增反應(yīng)步驟為：94 ℃預(yù)變性 3 min，循環(huán) 1 次；94 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s，此過程循環(huán)40 次；72 ℃終延伸 5 min，循環(huán) 1 次。并使用特定 16S rDNA 標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)各個(gè)細(xì)菌進(jìn)行絕對(duì)定量［16］。參照金迪［17］的方法計(jì)算所有細(xì)菌的拷貝數(shù)。引物序列見表2［18-23］。

1.4.3 飼糧及肌肉脂肪酸的提取分析 屠宰時(shí)采集每只羊的背最長肌200 g，真空密封包裝置于-20 ℃保存。肌肉脂肪酸提取前，用冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10ND，寧波）凍干粉碎后稱取0.2 g 肌肉樣，提取方法參照蘭貴生［24］。利用氣相色譜儀（TRACE 1300，賽默飛，米蘭，意大利）分析各脂肪酸含量，選用SCION-FAME（100 m×0.25 m×0.20 μm，賽恩，新西蘭）色譜柱，測(cè)定條件為：進(jìn)樣量1 μL，分流比為50∶1，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為240 和 250 ℃，空氣、氫氣和補(bǔ)償氣（氮?dú)猓┑牧髀史謩e為 400、40 和 20 mL·min-1，50 ℃持續(xù) 4 min，然后以 13 ℃·min-1升至 175 ℃持續(xù) 27 min，再以 3 ℃·min-1升至 215 ℃持續(xù) 27 min，37 種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲基酯樣品（37 FAME 標(biāo)準(zhǔn)品，色譜科，美國）和OBCFA 標(biāo)準(zhǔn)品（BR2，Larodan Fine Chemicals，馬爾默，瑞典），并用二十一烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行樣品中脂肪酸的測(cè)定與分析。隨機(jī)采集3 個(gè)處理組的飼料樣各20 g，飼料樣脂肪酸提取和分析方法同肌肉樣，飼料樣脂肪酸組成見表3。

表3 試驗(yàn)飼糧的脂肪酸組成Table 3 Fatty acid composition of the experiment diets（g·kg-1）

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2019 整理數(shù)據(jù)，用IBM SPSS Statistics 25.0 進(jìn)行單因素 ANOVA 分析，采用 Duncan 法進(jìn)行多重比較，其中P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著，0.05≤P＜0.10 表示有顯著的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧大麥粉碎粒度對(duì)湖羊血液指標(biāo)的影響

羊血液的 RBC、HGB、HCT、MPV、PLT、WBC、LYMPH、MONO、EO、NEUT、BASO、MCHC、MCV、MCH、RDW-SD 和RDW-CV 在不同處理間均無顯著差異（P＞0.05）（表 4）。

表4 飼糧大麥粉碎粒度對(duì)湖羊血液指標(biāo)的影響Table 4 Effects of barely particle size in diets on blood indexes of fattening Hu sheep

2.2 飼糧大麥粉碎處理對(duì)湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

大麥4 mm 粉碎組總菌和溶纖維丁酸弧菌數(shù)量顯著高于3 mm 粉碎組（P＜0.05），反芻獸新月形單胞菌數(shù)量顯著低于2 和3 mm 粉碎組（P＜0.05），產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著高于2 mm 粉碎組（P＜0.05）。普雷沃氏菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的數(shù)量各組差異不顯著（P＞0.05）（表5）。

表5 飼糧大麥粉碎粒度對(duì)瘤胃微生物組成的影響Table 5 Effect of barely particle size in diets on rumen microorganisms composition（lg 16S rRNA copy number·g-1 rumen microbial）

2.3 飼糧大麥粉碎粒度對(duì)育肥湖羊肌肉脂肪酸的影響

大麥 4 mm 粉碎組中的 C10：0、C12：0、C14：0 和 C14：1 的含量均顯著高于 2 mm 粉碎組（表 6），C18：2n-9t11t和 CLA 的含量顯著高于 3 mm 粉碎組（P＜0.05）。anteisoC15：0、C16：1、C18：2n6t 和 C18：2n-9c11t 的占比隨著粉碎粒度的增加有增加的趨勢(shì)（0.05≤P＜0.10）。

表6 飼糧大麥粉碎粒度對(duì)育肥湖羊肌肉脂肪酸的影響Table 6 Effect of barely particle size in diets on muscle fatty acid composition of fattening Hu sheep

續(xù)表Continued Table

3 討論

3.1 飼糧大麥粉碎處理對(duì)育肥湖羊血液指標(biāo)的影響

血液成分的變化代表著動(dòng)物健康狀態(tài)，能夠反映部分疾?。?5］。飼喂高谷物飼糧能顯著提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能，同時(shí)也會(huì)使瘤胃可降解淀粉含量增加，引起亞急性瘤胃酸中毒（subacute rumen acidosis，SARA），進(jìn)而引起機(jī)體炎癥反應(yīng)［26-28］，且本試驗(yàn)大麥淀粉在瘤胃中降解速度快，更易造成動(dòng)物機(jī)體患?。?9］。因此，血常規(guī)的檢測(cè)是有必要的，本研究結(jié)果顯示血常規(guī)指標(biāo)均在正常參考范圍內(nèi)［15］。白細(xì)胞能夠反映動(dòng)物的免疫能力，包括單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞［30］，對(duì)于維持正常的血液循環(huán)和疾病診斷有重要的意義［31］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3 組間血液WBC、MONO、EO、NEUT 和LYMPH 無顯著差異，表明大麥作為淀粉來源時(shí)，不同粉碎處理對(duì)育肥湖羊機(jī)體免疫功能沒有顯著影響。血液RBC 和HGB 可以作為判斷機(jī)體是否貧血的指標(biāo)［32］，反映動(dòng)物機(jī)體血液運(yùn)輸氧氣和二氧化碳的能力，PLT 的數(shù)量和功能與機(jī)體血液凝血系統(tǒng)相關(guān)，在維持血液循環(huán)中具有重要意義［33］。在本試驗(yàn)中，RBC、HGB 和PLT 均無顯著差異，可知大麥淀粉來源的飼糧對(duì)湖羊機(jī)體的血液氧化還原能力和凝血功能影響不顯著。馮躍進(jìn)［34］指出血液RDW 可反映紅細(xì)胞的變異程度，血液MCHC、MCH 和MCV 被稱為判定貧血的3 項(xiàng)指標(biāo)，較低的MCHC、MCH、MCV 和較高的RDW，可以鑒定為缺鐵性貧血。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧處理不會(huì)使湖羊機(jī)體出現(xiàn)貧血癥狀。可見，飼糧大麥粉碎粒度對(duì)湖羊血常規(guī)指標(biāo)無影響。

3.2 飼糧大麥粉碎處理對(duì)育肥湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

大麥不同粒度的粉碎會(huì)改變谷物和瘤胃微生物及酶的接觸面積，從而改變瘤胃可降解淀粉的含量，進(jìn)而改變瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)［11］，最終引起瘤胃微生物組成的變化，影響發(fā)酵速度和終產(chǎn)物的形成［35］。Plaizier 等［10］發(fā)現(xiàn)谷物粉碎處理飼喂奶牛誘導(dǎo)SARA 后，瘤胃pH 降低，瘤胃微生物中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌等纖維分解菌的含量明顯下降，相反，反芻獸新月形單胞菌和普雷沃氏菌等淀粉分解菌含量增加［36］。而在本試驗(yàn)中，4 mm 粉碎組的瘤胃微生物中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌含量增加，反芻獸新月形單胞菌的含量降低，這說明粗粉碎大麥可能會(huì)通過降低瘤胃可降解淀粉的含量而降低動(dòng)物患SARA 的風(fēng)險(xiǎn)。Andrés 等［37］將玉米進(jìn)行2 和6 mm 粉碎飼喂斷奶羔羊，2 mm 粉碎組飼喂羔羊的瘤胃中普雷沃氏菌等淀粉分解菌含量增加。本試驗(yàn)2 和3 mm 粉碎組淀粉分解菌反芻獸新月形單胞菌數(shù)量增加與此一致。Carlson 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，粒度的增加可能會(huì)延長營養(yǎng)物質(zhì)崩解所需的時(shí)間，并延遲微生物接觸可發(fā)酵有機(jī)物的時(shí)間，粒徑的增加是降低發(fā)酵速率和瘤胃酸中毒風(fēng)險(xiǎn)的有效方法。本試驗(yàn)中，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和溶纖維丁酸弧菌等纖維分解菌的數(shù)量在4 mm 粉碎組顯著增加，這可能是因?yàn)? mm 粉碎組中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）消化率顯著高于其他處理［39］，促進(jìn)了纖維分解菌的生長。

3.3 飼糧大麥粉碎處理對(duì)育肥湖羊肌肉脂肪酸的影響

本試驗(yàn)中，4 mm 粉碎組能夠提高 C10：0、C12：0 和 C14：0 等偶數(shù)碳脂肪酸的含量。雙金等［40］研究表明羊肉的膻味隨體脂中C10：0 含量的增加而加重，因此4 mm 粉碎組可能會(huì)增加羊肉的膻味。有研究表明延長丙酸和戊酸碳鏈可以形成直鏈奇數(shù)碳脂肪酸，延長乙酸主要得到偶數(shù)碳脂肪酸［41］。而在本試驗(yàn)中，2、3 和4 mm 粉碎組乙酸含量分別為 49.72、49.58 和 54.47 mmol·L-1，各組間無顯著差異［39］，4 mm 粉碎組僅在數(shù)值上有增長的趨勢(shì)，具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。瘤胃中生物氫化作用是產(chǎn)生CLA 的基礎(chǔ)，而溶纖維丁酸弧菌是生物氫化的優(yōu)勢(shì)菌群，在本試驗(yàn)中4 mm 粉碎組的溶纖維丁酸弧菌數(shù)量顯著增長，這可能促進(jìn)了生物加氫，與Vlaeminck 等［42］的結(jié)果相似。動(dòng)物采食谷物含量過高的飼糧會(huì)導(dǎo)致瘤胃氫化途徑發(fā)生改變［43］，主要是改變了在瘤胃生物氫化過程中起關(guān)鍵作用的溶纖維丁酸弧菌數(shù)量，使飼糧 cis-9，cis-12 C18：2n-6 氫化生成 cis-9，trans-11 C18：2 和 trans-11 C18：1 途徑轉(zhuǎn)變成了生成trans-10，cis-12 C18：2 和trans-10 C18：1。這些結(jié)果說明瘤胃中纖維分解菌通過影響微生物氫化而改變瘤胃液及內(nèi)容物中脂肪酸的組成，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品中脂肪酸組成發(fā)生變化［44］。亞麻酸和亞油酸等PUFA 不完全氫化可以合成 CLA［45］，在本試驗(yàn)中亞麻酸和亞油酸含量無顯著差異，但 C16：1、C18：2n-9c11t 等 PUFA 的含量有增加的趨勢(shì)，這也影響了CLA 的合成。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，大麥4 mm 粉碎組中纖維分解菌數(shù)量增加，反芻獸新月形單胞菌數(shù)量減少，肌肉脂肪酸中CLA 含量增加，因此，4 mm 粉碎處理大麥對(duì)湖羊瘤胃微生物區(qū)系和肌肉脂肪酸CLA 合成的影響效果最佳。