吳春燕 張立軍 張新玥 張轉(zhuǎn)平*

1. 陜西省安康市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 安康 725000；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

止痛膏為《中華人民共和國(guó)藥典》2010、2015、2020年版收載的制劑，主要以止痛流浸膏、水楊酸甲酯、薄荷腦、冰片、蕓香浸膏、顛茄浸膏等七味藥為原料，另加基質(zhì)制成膏藥。具有祛風(fēng)濕、活血止痛等功效。用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌肉疼痛、關(guān)節(jié)腫痛等病癥[1-3]，是國(guó)家基本用藥目錄收載品種[3- 4]。顛茄浸膏為止痛膏的重要組成部分，具有抗膽堿、解除平滑肌痙攣、抑制腺體分泌的作用，可用于胃及十二指腸潰瘍，胃腸道、腎、膽絞痛等，外用可解除肌肉痙攣，從而達(dá)到止痛的效果，是止痛外用膏藥的主要成分。而硫酸阿托品是顛茄浸膏指標(biāo)性成分和功效成分[5-7]。《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版及2020年版)收載止痛膏藥品中只見(jiàn)硫酸阿托品薄層鑒別，不能很好控制企業(yè)生產(chǎn)的膏藥質(zhì)量[3, 8-10]。顛茄浸膏藥性俊烈，具有一定的毒性，與諸多藥品具有使用配伍禁忌，有必要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制[11]。市場(chǎng)膏藥質(zhì)量參差不齊，不同生產(chǎn)廠家的止痛膏藥樣品中硫酸阿托品含量差異較大，存在非法或超劑量添加等情況，有必要提升控制標(biāo)準(zhǔn)，建立其含量測(cè)定控制線，保證膏藥質(zhì)量與患者用藥安全?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2015年版和2020年版)中僅對(duì)膏藥進(jìn)行了薄層色譜鑒別，難以控制其質(zhì)量。本次研究，對(duì)止痛膏中硫酸阿托品進(jìn)行了提取分離、含量測(cè)定，以期對(duì)市售止痛膏藥品進(jìn)行質(zhì)量控制。該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可為市售膏藥質(zhì)量控制提供思路。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，LC Solution色譜工作站；Phenomenex ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；硫酸阿托品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(供含量測(cè)定用，批號(hào)100040-201312)，乙腈為色譜純，水為超純水，三氯甲烷、磷酸二氫鉀、三乙胺、磷酸、氨水均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖液(取6.8 g磷酸二氫鉀溶于1000 mL水中，加入10 mL三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)(7∶93)為流動(dòng)相等度洗脫，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。在上述色譜條件下樣品中硫酸阿托品與其它組分分離較好，結(jié)果如圖1所示。

A.空白溶劑；B.硫酸阿托品對(duì)照品；C.傷濕止痛膏樣品圖1 HPLC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取硫酸阿托品對(duì)照品約20 mg，精密稱(chēng)定，置20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濃度為0.882 0 mg/mL備用，存貯于4 ℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 提取溶劑的選擇 止痛膏中膏藥一般用三氯甲烷或乙醚提取[3,12-13]。取樣品(陜西東科，批號(hào)：150708)適量，2份(片)，分別加入三氯甲烷、乙醚洗盡布襯膏藥，再用0.5%硫酸溶液提取4次，合并酸液，再用氨水調(diào)至PH為10～11，再分別用三氯甲烷、乙醚萃取4次，水浴蒸干，用流動(dòng)相定容，過(guò)濾，按“2.1”色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，結(jié)果顯示，相比于三氯甲烷處理，乙醚萃取轉(zhuǎn)移率較低，故選用三氯甲烷處理，見(jiàn)表1。

表1 兩種不同溶劑對(duì)樣品中硫酸阿托品提取的影響

2.3.2 酸提與堿沉次數(shù)的選擇[14-17]取樣品(陜西東科，批號(hào)：150708)適量，分成8份(片)，加入三氯甲烷洗盡布襯膏藥，分別置分液漏斗中。用0.5%硫酸溶液振搖提取，每次40 mL，考察提取次數(shù)(2、3、4次)，合并提取液，置分液漏斗中(酸提)。再用氨水調(diào)至PH為10～11，分別用三氯甲烷振搖萃取，每次40 mL，考察萃取次數(shù)(2、3、4次)，合并萃取液，分別置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干(堿萃)。殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶液定容10 mL容量瓶中，按“2.1”色譜條件進(jìn)樣分析，分別測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，0.5%硫酸溶液提取3次調(diào)堿后三氯甲烷萃取4次，樣品中硫酸阿托品轉(zhuǎn)移率為98.00%(631871/644767)；0.5%硫酸溶液提取3次調(diào)堿后三氯甲烷萃取3次，樣品中硫酸阿托品轉(zhuǎn)移率為97.84%(618212/631871)，見(jiàn)表2。故選擇用0.5%硫酸溶液提取3次,調(diào)堿后三氯甲烷萃取3次即可。

表2 不同提取次數(shù)對(duì)樣品中硫酸阿托品提取的影響

2.3.3 供試品溶液的制備 綜上分析，收集不同廠家生產(chǎn)的膏藥，做好標(biāo)記，剪去適量面積(cm2)，平行2份。加入三氯甲烷洗盡布襯膏藥，置分液漏斗中，分別用0.5%硫酸溶液提取3次，每次40 mL，合并酸溶液，用氨水調(diào)至PH為10～11，置分液漏斗中，再用三氯甲烷萃取3次，每次40 mL，合并三氯甲烷萃取液，水浴蒸干，用流動(dòng)相定容至10 mL量瓶中，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取硫酸阿托品對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(0.882 0 mg/mL)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mL，用甲醇溶解定容至5 mL，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，以峰面積Y對(duì)進(jìn)樣量X作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸線方程為Y=1×107X+5357.9，r=0.9991，結(jié)果表明硫酸阿托品在0.088 2 ～0.882 0 μg范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(陜西東科，批號(hào)150708)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定硫酸阿托品的峰面積，計(jì)算其RSD為1.07%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(陜西東科，批號(hào)150708)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，樣品中硫酸阿托品含量的RSD為1.75%(n=6)。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份(陜西東科，批號(hào)150708)，按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果表明，本法有良好的重復(fù)性，樣品中硫酸阿托品含量的RSD為1.45%(n=6)。

2.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批(陜西東科，批號(hào)：150708，含量為0.38 mg/100 cm2)樣品適量，平行6份，分別加入硫酸阿托品對(duì)照品約0.50 mg(對(duì)照品儲(chǔ)備液500 μL)，按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率(%)，平均回收率為95.73%，RSD為0.39%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn) (n=6)

2.9 不同廠家膏藥中硫酸阿托品含量測(cè)定 取不同廠家止痛膏供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算不同廠家止痛膏藥中硫酸阿托品的含量。結(jié)果顯示，不同廠家生產(chǎn)止痛膏樣品中硫酸阿托品含量差異較大，含量范圍在0.06～0.39/100 cm2，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 樣品處理考察 本次研究分別考察了不同提取溶劑、萃取次數(shù)及溶劑用量對(duì)止痛膏中硫酸阿托品提取結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用三氯甲烷萃取轉(zhuǎn)移率優(yōu)于乙醚，可能是因?yàn)橐颐演腿r(shí)容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，造成成分萃取不完全；乙醚容易揮發(fā)、易爆及危險(xiǎn)系數(shù)高，最終決定采用三氯甲烷作為提取和萃取溶劑[13, 17]。同時(shí)也考察了提取與萃取溶劑用量、萃取次數(shù)及PH對(duì)樣品中硫酸阿托品轉(zhuǎn)移的影響，最終優(yōu)選出上述樣品處理方法。

3.2 色譜條件考察 實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸緩沖鹽溶液、乙腈-磷酸緩沖鹽溶液，柱溫分別考察了30、 40 ℃對(duì)分離效果的影響，最終優(yōu)選出色譜條件為乙腈-磷酸緩沖鹽溶液等度洗脫(7∶93)，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫40 ℃，分析時(shí)間50 min。

3.3 耐用性與重現(xiàn)性考察 在上述優(yōu)選的條件下，分別考察了不同品牌的C18色譜柱(Phenomenex ODS C18、DiKMA spursil C18及Agilent ZORBAX SB-C18)、高效液相色譜儀(安捷倫與島津)及更換不同的分析人員在不同的實(shí)驗(yàn)室(化學(xué)室與中藥室)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果顯示新建立的止痛膏中硫酸阿托品含量測(cè)定方法耐用性及重現(xiàn)性均很好，RSD均小于3%。

3.3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 通過(guò)加入對(duì)照品回收實(shí)驗(yàn)分析，平均回收率為95.7%，RSD為0.39%，結(jié)果顯示優(yōu)選的方法具有很好的回收效果。

3.4 膏藥中硫酸阿托品含量測(cè)定方法小結(jié) 本研究采用溶劑萃取技術(shù)處理不同膏藥樣品，得含量測(cè)定分析提取物，通過(guò)對(duì)提取溶劑選擇、酸提堿沉次數(shù)及溶劑用量等進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，該方法被測(cè)成分硫酸阿托品轉(zhuǎn)移率高，轉(zhuǎn)移率為97.84%(618212/631871)建立了膏藥樣品處理方法。采用HPLC法建立膏藥中硫酸阿托品含量測(cè)定方法，通過(guò)專(zhuān)屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以及耐用性與重現(xiàn)性考察，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以用于止痛膏藥中硫酸阿托品含量測(cè)定及質(zhì)量控制。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定數(shù)據(jù)顯示，不同生產(chǎn)廠家的止痛膏藥樣品中硫酸阿托品含量差異較大，顛茄浸膏/流浸膏作為止痛膏重要組成部分，其硫酸阿托品為顛茄浸膏/流浸膏主要指標(biāo)和功效成分，建立膏藥中硫酸阿托品含量測(cè)定方法可以很好的用于膏藥質(zhì)量控制。