田 歌，韓玉虎，Gregori R，周柏玲

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)功能食品研究院，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，山西太原030031；3.加州大學(xué)植物科學(xué)系，美國加州戴維斯95616）

在果實(shí)的病理性軟化過程中，病原真菌的水解酶導(dǎo)致果實(shí)的細(xì)胞壁降解和軟化，同時(shí)，果實(shí)會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)以抵御病原菌的入侵。如多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP）[1]與病原真菌內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）形成一種高親和復(fù)合物，從而抑制endo-PG的部分活性[2]，減少對植物細(xì)胞壁的降解，減緩病原真菌的生長繁殖速度。有關(guān)PGIP的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能等方面國內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了廣泛、深入的研究[3]。PGIP是一種含有富亮氨酸重復(fù)區(qū)域的蛋白質(zhì)，能夠抑制多種真菌的多聚半乳糖醛酸酶的活性，干擾灰霉菌等多種真菌病害對植物組織的侵染過程，從而抑制真菌病害的發(fā)生。但有關(guān)蘋果PGIP抑制尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）的研究報(bào)道較少。

丹霞蘋果是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主選育的晚熟蘋果新品種，具有易成花、早豐產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)、易管理等優(yōu)良特性，其獨(dú)特風(fēng)味和濃郁香氣深受果農(nóng)和消費(fèi)者的青睞，在山西大規(guī)模栽種，也是華北、西北蘋果主產(chǎn)區(qū)的主栽品種之一[4]。但在果實(shí)采后貯藏中后期，由尖孢炭疽菌侵染致丹霞蘋果軟腐病發(fā)生嚴(yán)重，給果農(nóng)帶來重大損失。

本試驗(yàn)在前人有關(guān)PGIP研究的基礎(chǔ)上，從丹霞蘋果果實(shí)病斑提取、篩選、培養(yǎng)尖孢炭疽菌，測定尖孢炭疽菌病菌活性，同時(shí)從丹霞果實(shí)健康組織中提取PGIP，檢測PGIP對尖孢炭疽菌水解酶半乳糖醛酸酶（PG）的抑制作用，從細(xì)胞水平研究丹霞蘋果自身所具備的抑制尖孢炭疽菌感染的抗病因子，探索預(yù)防尖孢炭疽菌感染的新思路，旨在為防治蘋果軟腐病提供新途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蘋果品種丹霞由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所選育，成熟期收獲后在4℃下貯藏。

改良普拉特培養(yǎng)基（PM）[5]包含:13.6 g KH2PO4，4 g NH4NO3，1.25 g MgSO4·7H2O，0.02 g FeSO4·7H2O，0.001 g CuSO4·5H2O，0.002 g ZnSO4·7H2O，0.001 3 g（NH4）2MoO4，0.016 g MnSO4·H2O，0.028 g H3BO3，定容至1 L。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）購自美國西格瑪公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 尖孢炭疽菌分生孢子懸浮液的制備 從蘋果的感染組織中分離出尖孢炭疽菌，并在PDA上培養(yǎng)10 d，然后用無菌蒸餾水沖洗菌落制備病原菌分生孢子懸浮液，濃度為1×103個(gè)/mL。

1.2.2 尖孢炭疽菌的液體培養(yǎng) 用1 mol/L鹽酸將PM培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)至4.5，取9 mL培養(yǎng)基分裝到15 mL試管中，而后在121℃下高壓滅菌15 min。每個(gè)試管加入1 mL（濃度為1×103個(gè)/mL）尖孢炭疽菌的分生孢子懸浮液接種。在20℃下?lián)u培14 d。

1.2.3 尖孢炭疽菌分泌蛋白質(zhì)（PECA）提取 將尖孢炭疽菌的培養(yǎng)液離心（13 000×g，30 min），回收上清液（約5 mL）并添加1 mL緩沖液（0.05 mol/L NaCl和0.1 mol/L乙酸鈉，pH值5），再次離心（13 000×g，30 min）。收集上清液并過濾2次：第1次用微孔玻璃過濾器（密理博），第2次用微孔膜過濾器（0.45 μm）。將濾液用透析膜管（6.000-8.000 MWCO，Spectrapor）透析過夜（4℃，0.1 mol/L乙酸鈉，pH值5），從PM中提取的尖孢炭疽菌蛋白質(zhì)在4℃下儲(chǔ)存至使用[5]。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 蘋果健康組織蛋白質(zhì)（PEHT）提取 取6 g丹霞蘋果果實(shí)，在緩沖液（50 mmol/L乙酸鈉，pH值5，1%聚乙烯吡咯烷酮和1 mol/L NaCl）中均質(zhì)提取蛋白質(zhì)[6]。在4℃下勻漿1 h后在4℃下13 000×g離心5 min，并按1.2.3進(jìn)行過濾、透析和濃縮。蛋白質(zhì)提取物（PEHT）在4℃下儲(chǔ)存，次日使用[7]。

1.2.5 多聚半乳糖醛酸酶的活性分析

1.2.5.1 瓊脂糖徑向擴(kuò)散法 將1.5 g瓊脂糖、10 mg多聚半乳糖醛酸（PGA，F(xiàn)luka）和0.365 g乙二胺四乙酸加入150 mL0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH值5），加熱溶解，倒入23 cm×23 cm有機(jī)玻璃框中，冷卻凝固后使用[8]。

用軟木鉆在瓊脂片上打直徑為4 mm的孔。每孔加樣15 μL（PECA和PEHT），并在37℃下培養(yǎng)過夜。用釕紅（0.05%（m/V），F(xiàn)luka）染色，用樣孔周圍未染色（區(qū)域暈）面積來評估多聚半乳糖醛酸酶的活性。以黑曲霉的果膠酶（Sigma）作為標(biāo)準(zhǔn)多聚半乳糖醛酸酶陽性對照[9]，水和0.1 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH值5）為陰性對照。每樣3個(gè)重復(fù)。

1.2.5.2 分光光度法 反應(yīng)混合物（Reaction Mixture，RM）的制備：將50 μLPECA加入3 mL0.1%PGA和3 mL乙酸鈉緩沖液（0.05 mol/L，pH值5）中，在30℃水浴中孵育反應(yīng)，添加蘋果健康組織蛋白質(zhì)（PEHT）提取物進(jìn)行消化。在0（添加酶后立即）～28 h的不同時(shí)間間隔內(nèi)，每隔2 h取200 μL的RM等分樣品，添加1 mL 0.1 mol/L硼酸鈉（pH值9.6）中止反應(yīng)。然后分別添加300 μL的1%2-氰基乙酰胺試劑溶液，煮沸10 min后在276 mm處測量吸光度（島津UV-2401PC）。以半乳糖醛酸不加PECA和PEHT為標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

1.2.6 PGIP抑制活性的測定 取7.5 μL尖孢炭疽菌分泌的蛋白質(zhì)（PECA）分別添加在醋酸緩沖液稀釋（Ⅰ）、煮沸PEHT（Ⅱ）、新鮮PEHT（Ⅲ），以熱失活PEHT作為陰性對照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 尖孢炭疽菌的接種試驗(yàn) 用不銹鋼刀在丹霞蘋果中部劃口（3 mm×3 mm×3 mm），在傷口處接種20 μL尖孢炭疽菌分生孢子懸浮液[11]。室溫下靜置1 h，在傷口處注入等量的蒸餾水（尖孢炭疽菌＋H2O）、醋酸鹽緩沖液（尖孢炭疽菌＋buffer，0.1 mol/L，pH值5）、PEHT（尖孢炭疽菌＋PEHT），分別用蒸餾水（H2O＋H2O）和PEHT（PEHT＋H2O）處理的果實(shí)作陰性對照和陽性對照。

接種處理后，將試樣放在20℃和相對濕度較高的環(huán)境下，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)（第1年、第2年）。接種后第4天開始記錄病斑面積（mm2），連續(xù)記錄7 d。然后計(jì)算PEHT抑制尖孢炭疽菌病斑面積的縮小程度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行單因素方差分析。采用Fisher's LSD檢驗(yàn)分離平均值（P≤0.05）。使用統(tǒng)計(jì)軟件包Statistica for windows處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析前，用Bartlett檢驗(yàn)進(jìn)行方差顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢炭疽菌中多聚半乳糖醛酸酶活性檢測

瓊脂糖徑向擴(kuò)散分析結(jié)果顯示（圖1），在加載尖孢炭疽菌的樣孔周圍有一個(gè)清晰的區(qū)域（光暈）（孔3），陰性對照組（緩沖液和水）或健康組織的蛋白質(zhì)提取物PEHT中未觀察到活性，表明尖孢炭疽菌中多聚半乳糖醛酸酶活性良好[10]。

分光光度檢測結(jié)果顯示，尖孢炭疽菌的多聚半乳糖醛酸酶在28 h內(nèi)基本完成消化，并且在培養(yǎng)8～20 h期間表現(xiàn)高度線性相關(guān)（R2＝0.995 6）。根據(jù)16 h的測定結(jié)果，酶活性為3.2×104μg/（mg·h）（圖2）。進(jìn)一步驗(yàn)證了尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性良好。

2.2 丹霞蘋果蛋白提取物PEHT對尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶PG的抑制

在尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性良好的情況下，添加從健康丹霞蘋果中提取的蛋白質(zhì)PEHT，反應(yīng)結(jié)果在瓊脂糖徑向擴(kuò)散分析顯示，光暈明顯縮?。ǔ^65%）（P≤0.001 9）（圖3），表明PEHT對尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶的活性有明顯的抑制作用。

2.3 PGIP抑制尖孢炭疽菌接種試驗(yàn)

在新鮮丹霞果實(shí)上接種尖孢炭疽菌，結(jié)果顯示，接種4 d后所有果實(shí)均出現(xiàn)腐爛，第4天和第10天的病斑面積分別為36.01、861.32 mm2（表1，第1年）。然而，在接種傷口處添加PEHT，對尖孢炭疽菌的侵染產(chǎn)生了明顯的抑制作用。在接種初期，PGIP對尖孢炭疽菌的抑制性很強(qiáng)，接種后第4天，抑制率可達(dá)到54.5%。隨著接種時(shí)間的延長，PGIP對尖孢炭疽菌的抑制性逐漸降低，接種后第10天抑制率降為27.9%（表2，第1年）。第2年結(jié)果與第1年結(jié)果相似。綜上所述，在PEHT中存在抑制尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶活性的PGIP。

表1 丹霞蘋果蛋白提取物（PEHT）對尖孢炭疽病的抑制作用

表2 PGIP對尖孢炭疽菌的抑制率 %

3 結(jié)論與討論

前人研究報(bào)道了PGIP存在于柑橘[12]、葡萄柚[13]和豆類[14]中，表明其具有抗病特性。PARK等[15]研究發(fā)現(xiàn)，多聚半乳糖醛酸酶活性與衰變的嚴(yán)重程度與病斑直徑呈正相關(guān)，表明這種酶在病害發(fā)展過程中作為一種毒力因子發(fā)揮作用。在番茄[16]、蘋果[17]和覆盆子[18]等物種中，PGIP主要在果實(shí)組織中表達(dá)，而在豆類等物種中，PGIP可在植物的營養(yǎng)體部分和其他組織中表達(dá)[19]。

在本試驗(yàn)中，針對丹霞蘋果果實(shí)易染尖孢炭疽菌的特點(diǎn)，通過檢測丹霞蘋果果實(shí)PGIP對尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性的抑制試驗(yàn)和接種試驗(yàn)，探明丹霞蘋果果實(shí)內(nèi)部具有抑制尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性的PGIP蛋白，并對尖孢炭疽菌的侵染具有抑制作用。

前人研究表明，外源PGIP基因的引入增強(qiáng)了柿子對灰霉病菌的抗病性[20]，并且POWELL等[8]在實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)PGIP基因的番茄植株中灰霉病有所減少。本研究表明，PGIP在丹霞蘋果果實(shí)抵抗尖孢炭疽菌侵入方面有潛在防御作用。深入研究蘋果果實(shí)中PGIP抗病活性成分及抗病機(jī)制以及應(yīng)用生物技術(shù)和基因工程技術(shù)人工調(diào)控蘋果PGIP水平，最大限度抑制由尖孢炭疽菌導(dǎo)致的果實(shí)腐爛，為農(nóng)作物真菌病害的防控奠定基礎(chǔ)。