張祉思 程婉秋 江濤 沈志濱 陳艷芬 陳聰 司徒瑩 唐春萍

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）23-2854-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.07

摘 要 目的：研究滇烏堿誘導大鼠心律失常的毒性機制。方法：將32只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為正常對照組，滇烏堿低、高劑量組（0.09、0.14 mg/kg）和烏頭堿組（陽性對照，0.88 mg/kg），每組8只。各給藥組大鼠每天灌胃相應藥物1次，正常對照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)7 d。末次灌胃后，觀察各組大鼠的心電圖變化，測定大鼠心肌組織中腺苷三磷酸（ATP）含量、心肌細胞中Ca2+含量、心肌組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性以及雷諾定受體2（RyR2）、Ca2+-ATP酶（SERCA2）蛋白表達水平。結果：與正常對照組比較，滇烏堿低劑量組大鼠QRS波時限、校正后QT期間（QTc間期）均顯著延長（P<0.01），心肌細胞中Ca2+含量顯著升高（P<0.05），心肌組織中ATP含量、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性和SERCA2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;滇烏堿高劑量組和烏頭堿組大鼠心率均顯著增快（P<0.05或P<0.01），QRS波時限、QTc間期均顯著延長（P<0.01），心肌細胞中Ca2+含量均顯著升高（P<0.01），心肌組織中ATP含量、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性和RyR2、SERCA2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。結論：滇烏堿可導致大鼠心律失常;其作用機制可能與降低心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，下調心肌組織中鈣轉運相關蛋白RyR2、SERCA2的表達，從而導致Ca2+超載有關。

關鍵詞 滇烏堿;心律失常;鈣超載;腺苷三磷酸;雷諾定受體2;Ca2+-ATP酶;毒性機制

Study on the Toxicity Mechanism of Yunaconitine-induced Arrhythmia in Rats Based on Calcium Overload

ZHANG Zhisi1，CHENG Wanqiu1，JIANG Tao2，SHEN Zhibin1，CHEN Yanfen1，CHEN Cong1，SITU Ying1，TANG Chunping1，3（1.School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 2. Laboratory Animal Center， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Guangdong Engineering Research Center for Local Precise Drug Delivery， Guangzhou 510006， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the toxicity mechanism of yunacotine-induced arrhythmia in rats. METHODS： Totally 32 rats were randomly divided by random number table method into normal control group， yunacotine low-dose and high-dose groups （0.09， 0.14 mg/kg）， aconitine group （positive control， 0.88 mg/kg）， with 8 rats in each group. Administration groups were given the corresponding drugs once a day， and normal control group was given the constant volume of normal saline， for consecutive 7 d. After last intragastric administration， the changes of electrocardiogram （ECG） were observed. The contents of adenosine triphosphate （ATP） in myocardial tissue and Ca2+ in myocardial cells， the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase as well as the protein expression of ranolidine receptor 2 （RyR2） and Ca2+-ATPase （SERCA2） in myocardial tissue were determined. RESULTS： Compared with normal control group， time limit of QRS wave and QTc intervals of rats were prolonged significantly in yunaconitine low-dose group （P<0.01）. The content of Ca2+ in myocardial cells， the ATP contents， the activities of Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase as well as the protein expression of SERCA2 in myocardial tissue were reduced significantly （P<0.05 or P<0.01）. The heart rate of rats in yunaconitine high-dose group and aconitine group were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and time limit of QRS wave and QTc intervals were significantly prolonged （P<0.01）; the content of Ca2+ in myocardial cells was increased significantly （P<0.01）; ATP content， the activities of Ca2+-Mg2+-ATPase and Na+-K+-ATPase， and protein expression of RyR2 and SERCA2 in myocardial tissue were decreased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： Yunaconitine can induce arrhythmia in rats， the mechanism of which may be associated with Ca2+ overload that resulted from reducing the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase and down-regulating the expression of related calcium transporter RyR2 and SERCA2.

KEYWORDS? ?Yunaconitine; Arrhythmia; Calcium overload; Adenosine triphosphate; Ryanodine receptor 2; Ca2+ ATPase; Toxicity mechanism

黃草烏Aconitum vilmorinianum Kom.為毛莨科烏頭屬多年生草本植物的干燥塊根[1]，具有祛風散寒、活血止痛的功效，臨床用于治療風寒濕痹、跌打損傷和風濕關節(jié)疼痛等[2]，被收載于2005年版《云南省中藥材標準》[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黃草烏及其炮制品都有明顯的鎮(zhèn)痛作用，但其毒性劑量和療效劑量接近，限制了其在臨床的廣泛使用[4]。滇烏堿是從黃草烏中提取、分離得到的主要藥效成分，但也是毒性成分[5]。溫玉瑩等[6]的研究結果顯示，黃草烏經十二指腸給藥后，小鼠心律失常的發(fā)生率為100%。黎雖宇等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃草烏生品能使大鼠出現(xiàn)室性早搏等心律失?，F(xiàn)象;而黃草烏經炮制后，生物堿含量減少，且對大鼠心電圖的各項指標也無明顯影響，提示黃草烏炮制前后誘導大鼠心律失常的毒性差異可能與滇烏堿含量變化有關。然而，關于滇烏堿誘導心律失常的毒性機制仍未明確。

心律失常是最常見的心血管疾病，是主要由于心臟沖動起源部位、興奮秩序以及傳導速度異常而引起的心臟搏動頻率與節(jié)律障礙。心律失常不僅會加重原有心臟疾病的進展（如加速心力衰竭），而且也是導致患者發(fā)生猝死的重要原因之一[8]。Ca2+不僅是維持心臟電活動的關鍵因素，也是引發(fā)心肌收縮的直接激活劑，因此任何引起Ca2+含量波動的因素都會影響心肌興奮-收縮偶聯(lián)（ECC）過程，最終導致心律失常[9]?；诖?，本研究擬從整體動物水平觀察滇烏堿對大鼠心電圖的影響，并探究其對腺苷三磷酸（ATP）含量及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性、Na+-K+-ATP酶活性、心肌細胞中Ca2+含量、鈣轉運相關蛋白表達水平的影響，進一步揭示滇烏堿誘導心律失常的毒性機制，為黃草烏的臨床安全使用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BL-420F型生物信號采集處理系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司），Infinite 200 PRO型多功能熒光酶標儀（奧地利Tecan Austria GmbH公司），HZT-A1000型電子天平（福州華志科學儀器有限公司），3100型CO2培養(yǎng)箱（廣州市源起生物科技有限公司），Mini型蛋白電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），LG2000型數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（杭州朗基科學儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

滇烏堿對照品（批號MUST17102101，純度≥98%）、烏頭堿對照品（批號MUST17110910，純度≥98%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;ATP含量測定試劑盒（批號20200712）、ATP酶活性測定試劑盒（批號20200628）和二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號20200723）均購自南京建成生物工程研究所;Fluo-3/AM Ca2+熒光探針（批號75400150）購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司;兔源雷諾定受體2（RyR2）單克隆抗體（批號GR3200692-1）購自美國Proteintech公司;兔源Ca2+-ATP酶（SERCA2）單克隆抗體（批號GR3182873-9）、兔源3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（批號GR3250452-7）均購自英國Abcam公司;山羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記的免疫球蛋白G（IgG）抗體（批號GR3321256-8）購自美國Bioworld公司;超敏ECL化學發(fā)光即用型底物（批號B347825E）購自美國Boster公司;其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD大鼠，共32只，雌雄各半，體質量為240～260 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK（粵）2018-0002、質量合格證號為44007200078479。大鼠購入后飼養(yǎng)于廣東藥科大學實驗動物中心SPF級動物房中[實驗動物使用許可證號為SYXK（粵）2017-0125]。實驗室環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～70%，12 h照明/12 h黑暗循環(huán)。本實驗動物方案已獲得廣東藥科大學實驗動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1 分組與給藥

采用隨機數(shù)字表法將32只大鼠隨機分為正常對照組，滇烏堿低、高劑量組（0.09、0.14 mg/kg）和烏頭堿組（陽性對照，0.88 mg/kg），每組8只。各給藥組大鼠的給藥劑量是參考文獻[10-11]及前期預實驗結果設置，其中滇烏堿低、高劑量分別為大鼠的1/6、1/4半數(shù)致死量（LD50），烏頭堿的劑量為大鼠的1/10 LD50。各給藥組大鼠灌胃相應藥物（均以生理鹽水為溶劑溶解），正常對照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水;灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)7 d。

2.2 心電圖觀察

末次灌胃1 h后，腹腔注射3%水合氯醛（10 mL/kg）將大鼠麻醉，然后將大鼠按仰臥位固定，并將正向電極插入其右上肢，負向電極插入其左下肢，底線插入其右下肢，然后使用生物信號采集系統(tǒng)采集大鼠60 min內的Ⅱ導聯(lián)心電圖，記錄并分析其心率、QRS波、PR間期以及校正后QT間期（QTc間期）的變化。其中，QTc間期是根據(jù)公式QTc=QT/RR1/2計算得到（RR為標準化的心率值，根據(jù)60除以心率得到）[6]。

2.3 標本采集與處理

記錄大鼠的心電圖后，將大鼠處死，打開其胸腔，在無菌條件下迅速剝離其心臟。心臟用生理鹽水沖洗，并用濾紙吸干，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.4 心肌組織中ATP含量測定

稱取心肌組織樣本0.1 g，以水制成100 g/L的勻漿液后，置于沸水浴中煮10 min;取出，渦旋混勻1 min，然后以3 500 r/min離心10 min，取上清液。根據(jù)ATP含量測定試劑盒說明書方法操作，通過酶標儀測定各組大鼠心肌組織中ATP的含量。

2.5 心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性測定

稱取心肌組織樣本0.1 g，以水制成100 g/L的勻漿液，按照ATP酶活性測定試劑盒說明書方法操作，測定大鼠心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性。采用BCA法測定各組大鼠心肌組織勻漿液的蛋白濃度，ATP酶的活力單位以每小時每毫克蛋白分解ATP產生無機磷的量（μmol Pi/mg prot/h）表示。

2.6 心肌細胞中Ca2+含量測定

稱取心肌組織樣本約50 mg，加入水充分研磨，于300目尼龍網(wǎng)上過濾得到細胞懸液;以1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞2遍，隨后加入含有5 μmol/L Fluo-3/AM Ca2+熒光探針的無血清DMEM培養(yǎng)基5 mL，再加入1 μL 25%Pluronic F127，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h;取出，以? ? ?1 000 r/min離心5 min，以PBS洗滌3次，洗脫未負載的Fluo-3/AM Ca2+熒光探針;然后使用酶標儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm處檢測大鼠心肌細胞中Ca2+的熒光強度（熒光強度越高代表Ca2+的含量越高）。

2.7 心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達測定

每組隨機選取3只大鼠的心肌組織樣本，采用Western blot法進行測定。稱取心肌組織樣本約100 mg，加入裂解液提取總蛋白;以BCA法進行蛋白定量分析，然后將蛋白高溫變性。取變性后的蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離（分離膠電壓為100～200 V，濃縮膠電壓為60～100 V，電泳時間為60 min），隨后濕法轉至聚偏二氟乙烯膜（轉膜電流均為300 mA，RyR2蛋白的轉膜時間為130 min，SERCA2蛋白的轉膜時間為90 min）;以5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入RyR2一抗（稀釋比例為1 ∶ 2 000）、SERCA2一抗（稀釋比例為1 ∶ 3 000）、GAPDH一抗（稀釋比例為1 ∶ 10 000），于4 ℃孵育過夜;以TBST漂洗6次、每次5 min，加入HRP標記的IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 40 000），于室溫孵育1 h;以TBST漂洗6次、每次5 min，加入ECL顯色，于化學發(fā)光成像儀中成像。采用Image J v1.8.0軟件測定各蛋白條帶的灰度值，以各目的蛋白條帶與內參GAPDH蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 滇烏堿對大鼠心電圖的影響

正常對照組大鼠保持竇性心律。與正常對照組比較，滇烏堿低劑量組大鼠QRS波時限和QTc間期均顯著延長（P<0.01），以產生室性期前收縮的心電圖變化為主;滇烏堿高劑量組大鼠心率顯著增快（P<0.05），QRS波時限和QTc間期均顯著延長（P<0.01），主要表現(xiàn)為雙向性室性心動過速;烏頭堿組大鼠的心率顯著增快（P<0.01），QRS波時限和QTc間期均顯著延長（P<0.01），主要表現(xiàn)為單形性室性心動過速等心電異常。與烏頭堿組比較，滇烏堿低、高劑量組大鼠心電圖各參數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠的心電圖見圖1，心電圖各參數(shù)測定結果見表1。

3.2 滇烏堿對大鼠心肌組織中ATP含量的影響

與正常對照組比較，滇烏堿低、高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中ATP含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與烏頭堿組比較，滇烏堿低、高劑量組大鼠心肌組織中ATP含量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠心肌組織中ATP含量測定結果見表2。

3.3 滇烏堿對大鼠心肌組織中ATP酶活性的影響

與正常對照組比較，滇烏堿低、高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與烏頭堿組比較，滇烏堿低、高劑量組大鼠心肌組織中上述ATP酶活性差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠心肌組織中ATP酶活性測定結果見表2。

3.4 滇烏堿對大鼠心肌細胞中Ca2+含量的影響

與正常對照組比較，滇烏堿低、高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌細胞中Ca2+含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與烏頭堿組比較，滇烏堿低、高劑量組大鼠心肌細胞中Ca2+含量差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠心肌細胞中Ca2+含量測定結果見表2。

3.5 滇烏堿對大鼠心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達的影響

與正常對照組比較，滇烏堿低劑量組大鼠心肌組織中SERCA2蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），但RyR2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;滇烏堿高劑量組和烏頭堿組大鼠心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。與烏頭堿組比較，滇烏堿低劑量組大鼠心肌組織中SERCA2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），RyR2蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）;滇烏堿高劑量組大鼠心肌組織中RyR2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），SERCA2蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。各組大鼠心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達的電泳圖見圖2，蛋白表達水平測定結果見表3。

4 討論

心電圖記錄了心臟興奮的產生、傳導、恢復過程中的生物電變化，在臨床中反映了患者的心臟功能，是監(jiān)測、診斷心血管疾病的重要指標之一[12]。QRS波是心室除極波，QRS波群時限延長可能與室性異位激動產生的心室除極有關[13]。PR間期代表由竇房結產生的興奮經由心房、房室交界和房室束到達心室并引起心室開始興奮所需要的時間，若PR間期異常，則提示興奮傳導異常;QTc間期延長可導致室性心律失常的發(fā)生，在診斷某些心律失常和判斷心肌梗死患者預后等方面有著重要的臨床意義[14]。由于烏頭堿是烏頭屬植物最主要的心臟毒性物質，能引起多種心律失常，故可作為烏頭屬植物毒性成分的典型代表[15]。因此，本研究以烏頭堿為陽性對照藥物來考察滇烏堿致大鼠心律失常的毒性作用。心電圖觀察結果顯示，給予不同劑量的滇烏堿后，大鼠的心率不同程度地加快，QRS波時限和QTc間期不同程度地延長，并且出現(xiàn)了室性早搏、室性心動過速等心律失?，F(xiàn)象。

細胞內Ca2+作為第二信使，可以介導以膜電位變化為特征的興奮過程和以肌絲滑行為基礎的收縮過程，即ECC過程;若細胞內Ca2+濃度異常，可導致心臟傳導速度減慢、心室收縮功能減弱，從而影響心臟功能的正常發(fā)揮[16]。Na+-K+-ATP酶又稱鈉泵，是廣泛存在于心肌及其他組織細胞膜上的一種糖蛋白，也是一種能催化ATP水解的酶，這種泵每消耗1分子 ATP所釋放的能量就可逆濃度將3個Na+泵出細胞外，同時將2個K+泵入細胞內;一旦Na+-K+-ATP酶活性降低，就會造成細胞內Na+濃度過高，間接促進Na+-Ca2+交換，從而引起細胞內Ca2+超載，導致心肌的興奮-收縮功能紊亂[17]。Ca2+-Mg2+-ATP酶又稱鈣泵，能夠利用水解ATP釋放的能量驅動細胞內Ca2+泵出細胞，以維持細胞內低濃度的游離Ca2+;當Ca2+-Mg2+-ATP酶活性受到抑制時，容易導致心肌游離Ca2+濃度過高，而Ca2+超載程度與心肌損傷程度呈正相關[18]。心肌細胞中過多的Ca2+以磷酸鹽的形式沉積，引起線粒體氧化磷酸化的電子傳遞功能障礙，造成ATP合成受阻，導致能量無法轉化成ATP為心肌所用，進一步抑制ATP酶活力，形成“ATP合成障礙-Ca2+超載”的惡性循環(huán)，從而誘導心律失常發(fā)生[19]。本研究結果顯示，給予不同劑量滇烏堿后，大鼠心肌組織中ATP含量不同程度地減少，心肌細胞中Ca2+含量不同程度地增加，心肌組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性不同程度地降低。這提示Ca2+超載可能是滇烏堿致大鼠心律失常的毒性機制之一。

在ECC過程中，相關鈣轉運蛋白的調控紊亂會導致胞漿Ca2+負載和肌漿網(wǎng)中Ca2+釋放失調，這也是引起Ca2+依賴型心律失常的關鍵因素[20]。RyRs又稱蘭尼堿受體，是位于肌漿網(wǎng)中的一種選擇性陽離子通道。據(jù)文獻報道，RyRs有3種亞型，其中RyR2是主要的Ca2+釋放通道，主要分布于心肌，對細胞質內游離Ca2+的濃度影響尤為顯著：正常情況下，當興奮沖動傳導至心肌細胞時，L型Ca2+通道開放，然后細胞外少量的Ca2+內流，而短時間內迅速升高的游離Ca2+濃度會增加RyR2對Ca2+的敏感性，使RyR2被激活并同步釋放大量Ca2+，引起心肌收縮[21]。但游離Ca2+在胞漿內對RyR通道具有雙向調節(jié)作用：當Ca2+處于低濃度（0.01～1 mmol/L）時，可以刺激并激活RyR2通道;當細胞內的Ca2+濃度達到1 mmol/L時，RyR2通道的開放程度達到最大;此時若Ca2+濃度繼續(xù)升高（>1 mmol/L），心肌組織為避免過長或過強的收縮，則會抑制RyR2通道開放[22]。在ECC過程中，待心肌細胞處于舒張期后，廣泛表達于真核細胞肌漿網(wǎng)中的SERCA2則可以利用ATP供能，驅動胞漿內Ca2+重新泵入鈣庫中，從而降低胞漿中Ca2+濃度，以維持細胞內外Ca2+的動態(tài)平衡，同時為心肌細胞的下一次收縮儲存足夠的Ca2+量[23]。本研究結果顯示，給予不同劑量滇烏堿后，大鼠心肌組織中RyR2、SERCA2蛋白表達均不同程度地下調，表明滇烏堿可造成肌漿網(wǎng)對Ca2+的再攝取功能障礙，從而導致Ca2+超載，使心肌細胞喪失自律性、興奮性、傳導性等生理功能，最終引起病理狀態(tài)下心肌收縮、舒張功能的障礙。

綜上所述，滇烏堿可導致大鼠心律失常;其毒理學機制可能與降低心肌組織中Ca2+-Mg2+-ATP酶、Na+-K+-ATP酶活性，下調心肌組織中鈣轉運相關蛋白RyR2、SERCA2的表達，從而導致Ca2+超載有關。

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（收稿日期：2021-07-20 修回日期：2021-10-20）

（編輯：林 靜）