劉金月，李曉霞，王海鷹，唐時幸，萬成松

南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510515

登革病毒（DENⅤ）引發(fā)的登革熱（DF）是全球重大蟲媒傳染病，在熱帶、亞熱帶地區(qū)均有流行。隨著氣候變化和人口流動增多，登革熱日益嚴(yán)重［1,2］。據(jù)統(tǒng)計，DENⅤ原發(fā)性感染大部分為隱性感染［3］，可作為傳染源導(dǎo)致更多感染發(fā)生［4］。目前，DENⅤ存在四種血清型（DENⅤ1-4），單一血清型的原發(fā)感染能產(chǎn)生該特定血清型持久的同型免疫，但對其他血清型只能產(chǎn)生短暫的免疫保護(hù)［5］。研究表明，DENⅤ二次異型感染更易引發(fā)重癥，包括致死性登革出血熱（DHF）和登革休克綜合征（DSS）等［6,7］，給疾病防控帶來沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)［8］。另一方面，猩猩、猴類等動物對登革病毒易感，是叢林型登革熱的主要傳染源，可通過蚊媒感染人。因此，建立準(zhǔn)確、便捷的DENⅤ檢測技術(shù)，能提升DENⅤ現(xiàn)場或野外監(jiān)測站點(diǎn)的檢測能力，便于開展島礁、邊防、叢林等特殊哨點(diǎn)的DENⅤ早期篩查、流行病學(xué)調(diào)查。

DENⅤ實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法有病毒分離、RT-PCR、抗體檢測等，病毒分離法操作繁多、費(fèi)時；RT-PCR檢測核酸，快速、準(zhǔn)確、便捷，但不反映抗體水平；抗體檢測是目前最常用的快速檢測技術(shù)［10］。通過抗體檢測，DENⅤ原發(fā)感染發(fā)病后8～10 d，可檢測到IgG抗體［11］，并在體內(nèi)維持多年［12］，二次感染時迅速增多［13］，已作為區(qū)分原發(fā)感染和繼發(fā)感染的指標(biāo)。但辣根過氧化物酶聯(lián)免疫法測量光密度（OD值），檢測范圍較窄；特殊動物檢測所需的種屬二抗難獲取，應(yīng)用范圍受限；抗原制備、蛋白表達(dá)、純化折疊復(fù)雜，制備周期較長。

本研究采用G蛋白捕獲血清中IgG抗體，Nanoluc熒光素酶與DENⅤ特異性抗原融合表達(dá)蛋白為檢測抗原，檢測DENⅤIgG特異性抗體，建立基于DENⅤE蛋白的熒光素酶免疫吸附法（DENⅤ-LISA）［14］，具有特異、快速、靈敏、不需要種屬二抗等特點(diǎn)，為人群中DENⅤ感染的篩查、預(yù)警與自然疫源地病原微生物大規(guī)模監(jiān)測、風(fēng)險評估提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑與樣本

DENⅤ1（GenBank：ΚM204119.1），DENⅤ2（GenBank：ΚU094070.1）。293T 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5ɑ（北京天根生物科技），熒光素酶表達(dá)載體pNLF1-N和發(fā)光底物（Promega），病毒RNA提取試劑盒（Qiagen），質(zhì)粒提取試劑盒（廣州美基生物科技），脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑（上海翊圣生物科技），G蛋白（金斯瑞生物科技），商用DENⅤIgG 檢測試劑盒（ELISA）（中山生物）。登革病人血清樣本由本實(shí)驗(yàn)室、廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，正常人血清樣本由南方醫(yī)院提供。

1.2 構(gòu)建pNLF1-E1、pNLF1-E2熒光素酶表達(dá)載體

根據(jù)DENⅤE基因核苷酸序列［15,16］，設(shè)計引物（表1），并在5'端引入EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)（斜體加粗），3'端引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)（斜體加粗）和蛋白標(biāo)簽（下劃線），交由生工生物工程（上海）合成。提取病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增DENⅤ1-E1、DENⅤ2-E2基因片段，純化、回收；經(jīng)雙酶切，連接至pNLF1-N載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，對測序正確的菌株經(jīng)37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，提取pNLF1-E1、pNLF1-E2重組質(zhì)粒。

表1 擴(kuò)增DENⅤ1-E1、DENⅤ2-E2的引物序列及位置Tab.1 Primer sequences and locations of the coding sequences of DENV1-E1 and DENV2-E2

1.3 轉(zhuǎn)染、獲取NLu-E1、NLu-E2融合蛋白

將293T細(xì)胞無抗生素培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染pNLF1-E1、pNLF1-E2重組質(zhì)粒至293T細(xì)胞中，8 h后更換維持培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h，裂解細(xì)胞，經(jīng)4 ℃、13 000g離心10 min，保存細(xì)胞裂解上清液。

1.4 Western blot檢測NLu-E1、NLu-E2融合蛋白表達(dá)

將上述細(xì)胞裂解上清液加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，置于100 ℃金屬浴，加熱10 min，使蛋白變性。按照等蛋白質(zhì)量上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用半干轉(zhuǎn)膜法，轉(zhuǎn)印至0.45 μm NC膜，使用抗蛋白標(biāo)簽鼠單克隆抗體作為一抗（1∶5000稀釋），HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG作為二抗（1∶10 000稀釋），進(jìn)行ECL檢測。

1.5 建立DENⅤ-LISA檢測

使用G蛋白，按照每孔100 μL，包被96孔白色酶標(biāo)板，4 ℃孵育12 h；5%脫脂奶粉（0.05%PBST稀釋）37 ℃封閉2 h；0.05%PBST洗板1次，2%脫脂奶粉稀釋待測樣品，每孔加樣95 μL，37 ℃孵育2 h；洗板3 次，將NLu-E1與NLu-E2細(xì)胞裂解液等量混勻，按照1∶200稀釋，每孔加樣50 μL，37 ℃孵育45 min；棄液，洗板3次，加入熒光素酶發(fā)光底物，使用酶標(biāo)儀讀取相對熒光值（RFI）。以經(jīng)兩種檢測方法檢測為陽性的樣本為陽性對照，以正常人樣本為陰性對照，2%脫脂奶粉為空白對照。根據(jù)RFI判斷血清樣品中是否存在特異性抗體，將20份正常人血清樣品RFI均值的二倍定義Cut-off值，樣品RFI大于該值即判斷為陽性。

1.6 特異性、靈敏度及穩(wěn)定性評價

檢測68份DENⅤ感染的病人血清樣本、20份正常人血清樣本與9份基孔肯雅病毒（CHIΚⅤ）感染的病人血清樣本，計算DENⅤ-LISA的陽性檢出率及特異度。分別使用DENⅤ-LISA 和商用檢測試劑盒，對DENⅤIgG陽性血清樣本和正常人血清樣本進(jìn)行梯度稀釋，同時比較兩種方法的靈敏度。使用同一批次3張酶標(biāo)板做重復(fù)性試驗(yàn)，每次試驗(yàn)每個樣品做3個復(fù)孔，分別分析板間、板內(nèi)RFI 差異，計算變異系數(shù)，評價DENⅤ-LISA的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 DENⅤ-LISA的建立

挑取DH5α/pNLF1-E1/E2 陽性菌落進(jìn)行PCR，1.3%瓊脂糖凝膠電泳，可見單一特異條帶，與預(yù)計的DENⅤ1-E1與DENⅤ2-E2片段大小相似，測序結(jié)果與預(yù)期一致；Western blot結(jié)果顯示，在預(yù)計蛋白相對分子質(zhì)量處，pNLF1-E1/E2轉(zhuǎn)染組標(biāo)簽蛋白有特異印跡反應(yīng)，pNLF1-N 空載體轉(zhuǎn)染組與空白對照組無顯色條帶，提示NLu-E1 與NLu-E2 融合蛋白表達(dá)成功。建立DENⅤ-LISA 技術(shù)，在1∶400 稀釋度下，DENⅤIgG 陽性樣本的RFI 明顯高于正常人樣本，表明DENⅤ-LISA建立成功（圖1）。計算正常人血清樣本RFI的算術(shù)均數(shù)，其二倍為31 405，取整，定義Cut-off 值為30 000。

圖1 DENⅤ1-LISA的建立Fig.1 Establishment of DENV1-LISA.A:Identification of clone DH5α/pNLF1-E1/E2.Lane 1:PCR product of E1 from DH5α/pNLF1-E1;Lane 2:PCR product of E2 from DH5α/pNLF1-E2.B:Western blotting for identification of NLu-E1 fusion protein.1:pNLF1-E1;p:pNLF1-N;c:Blank control.C:Western blotting for identification of NLu-E2 fusion protein.2:pNLF1-E2;p:pNLF1-N;c:Blank control.D:DENV-LISA.

2.2 特異性評價

共檢測97份血清樣本，DENⅤ-LISA陽性檢出率32.4%，特異度100%，CHIΚⅤ假陽性率11.1%；商用ELISA檢測試劑盒陽性檢出率35.3%，特異度100%，假陽性率0（表2）。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩種方法陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Kappa系數(shù)0.47（P＜0.01）。

表2 特異性試驗(yàn)Tab.2 Specificity test of the assay

2.3 靈敏度評價

DENⅤ-LISA與商用ELISA試劑盒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果顯示，DENⅤ-LISA中，稀釋6400倍時可以判斷陽性，其中1號樣本在12 800倍稀釋時仍可判斷為陽性；商用ELISA檢測試劑盒按照說明書設(shè)定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，在稀釋1600倍時已無法判斷陽性樣本（圖2）。

圖2 靈敏度試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity test of DENV-LISA.A:DENV-LISA;B:Commercial ELISA.

2.4 穩(wěn)定性評價

DENⅤ-LISA 3次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。板內(nèi)變異系數(shù)0.46%～4.69%，板間變異系數(shù)3.66%～9.37%，同批板間、板內(nèi)變異系數(shù)均低于10%；經(jīng)方差分析，板間、板內(nèi)RFI差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示該方法檢測效果穩(wěn)定、重復(fù)性良好。

表3 DENⅤ-LISA重復(fù)性試驗(yàn)Tab.3 Repeatability test of DENV-LISA

3 討論

DENⅤ繼發(fā)性感染可引發(fā)嚴(yán)重的DHF/DSS。研究表明，DENⅤ突變可能改變了DENⅤ的抗原性，患者再次暴露時，獲得的免疫失去保護(hù)作用［17］；患者的流動能造成非流行區(qū)的本地傳播，當(dāng)患者來自其他國家或隱性感染時，傳播風(fēng)險更大［18,19］。檢測DENⅤIgG抗體能有效區(qū)分初次感染和繼發(fā)感染［20］，如果IgG抗體滴度在患者發(fā)病1周內(nèi)迅速增高，提示患者可能為繼發(fā)感染，作為登革熱重癥預(yù)警指征［5］；為保證接種的安全性和有效性，DENⅤ疫苗接種前應(yīng)檢測血清抗體［21］。因此，建立DENⅤ-LISA用于人群中DENⅤIgG抗體水平篩查，可及時發(fā)現(xiàn)隱性感染患者，避免疫情跨區(qū)域傳播，降低DHF/DSS發(fā)生概率。

本研究采用的Nanoluc熒光素酶在底物催化下發(fā)出熒光，相較于傳統(tǒng)辣根過氧化物酶（HRP），光強(qiáng)度高、衰減速度慢，適用于開發(fā)新的酶免疫吸附檢測系統(tǒng)［22,23］。G蛋白能結(jié)合人和動物的IgG抗體，因此，DENⅤ-LISA沒有種屬特異性，不需要動物源性二抗，使檢測應(yīng)用范圍更廣泛。

目前，DENⅤ血清學(xué)抗體檢測主要針對E蛋白特異性抗體，但是抗體檢測不可避免存在交叉反應(yīng)［24］；此外，CHIΚⅤ感染臨床癥狀與DENⅤ感染類似，這給抗體檢測增加了難度，要求檢測抗原具備更高特異性［25］。

商品化DENⅤIgG ELISA試劑盒多為C6/36細(xì)胞培養(yǎng)病毒獲取檢測抗原，或利用原核表達(dá)系統(tǒng)制備檢測抗原。而本研究利用基因工程技術(shù)及真核表達(dá)系統(tǒng)，獲取NLu-E1與NLu-E2融合蛋白作為檢測抗原，既避免培養(yǎng)病毒，又保留天然表位，降低抗原制備的危險性與難度，制備時間短，成本低［26］。本研究還發(fā)現(xiàn)，以NLu-E1作為檢測抗原，陽性檢出率10.3%，特異度96.6%；以NLu-E2 作為檢測抗原，陽性檢出率29.4%，特異度89.7%；以NLu-E1/E2 作為檢測抗原，陽性檢出率32.4%，特異度96.6%。結(jié)果顯示，NLu-E1與NLu-E2存在不同的抗原表位，并且組合使用，增加了陽性檢出率和檢測特異性［27］。NLu-E1、NLu-E2分別作為檢測抗原，陽性檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可能因?yàn)镋蛋白第一、第三區(qū)域存在型特異性表位［28］。全類型檢測試劑盒使用DENⅤ1-4混合抗原，本研究使用DENⅤ1與DENⅤ2混合抗原，陽性檢出率（32.4%）與全類型檢測試劑盒（35.3%）差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？赡芤?yàn)檠鍢颖緛碜詮V東省，患者主要感染DENⅤ1或DENⅤ2［29］，與本研究使用檢測抗原來源一致。DENⅤ全類型檢測增加了IgG抗體結(jié)合位點(diǎn)，但由于存在空間位阻效應(yīng)，可能會影響抗原與抗體的特異性結(jié)合［24］。

本研究正常人血清樣本中未檢出陽性，CHIΚⅤ患者樣本假陽性率11.1%（1/9），假陽性率較低［30］，特異度高，優(yōu)于部分檢測試劑盒。登革熱患者血清樣本IgG抗體陽性檢出率32.4%，與商用檢測試劑盒持平，但總體偏低，可能是部分患者采血時處于病程早期，體內(nèi)尚未產(chǎn)生足量E蛋白特異性IgG抗體［31］。

采用DENⅤ-LISA技術(shù)，樣品稀釋12 800倍時，仍可檢出陽性，靈敏度高于商用檢測試劑盒，可以更早地檢測出患者體內(nèi)IgG抗體。由于樣品數(shù)量有限，且缺乏流行病學(xué)資料，靈敏度與陽性檢出率之間的關(guān)聯(lián)，有待更多臨床樣本，做進(jìn)一步驗(yàn)證。

DENⅤ-LISA重復(fù)性試驗(yàn)顯示，同批板間、板內(nèi)RFI變異系數(shù)均小于10%，低于檢測試劑盒規(guī)定的15%，重復(fù)性好；檢測抗原置于-20 ℃，保存6個月，陽性檢出率和特異度沒有變化。由于檢測抗原直接取細(xì)胞裂解上清液，裂解液中加入甘油，可防止冰晶形成，以延長保存時間，并保持活性［32,33］。

綜上所述，本研究使用DENⅤE蛋白兩段特異性序列編碼的融合蛋白，作為檢測抗原，檢測登革病毒IgG抗體，建立DENⅤ新型熒光素酶免疫吸附檢測技術(shù)，特異性好，靈敏度高，重復(fù)性強(qiáng)，制備簡便，成本低，可應(yīng)用于登革熱的流行病學(xué)調(diào)查、自然疫源地病原微生物的早期篩查、監(jiān)測預(yù)警、跨種傳播、溯源和傳染病疫情風(fēng)險評估等。