蔡田雨，陳雪雷，程 錦，程振宇，吳曉明，齊世美，戚之琳

皖南醫(yī)學(xué)院1生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，2活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002

腫瘤細(xì)胞在常氧條件下亦可通過糖酵解途徑產(chǎn)生大量乳酸，這種被稱為瓦伯格效應(yīng)的現(xiàn)象是腫瘤細(xì)胞代謝的重要特點(diǎn)［1］。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的大量乳酸通過細(xì)胞膜上的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（MCFs）釋放至胞外。腫瘤微環(huán)境中的乳酸作為信號分子通過G蛋白偶聯(lián)受體GPR81介導(dǎo)的信號途徑，參與調(diào)控腫瘤血管形成、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和化療抵抗等過程［2,3］。雖然已有大量的研究證明乳酸與多種類型腫瘤的不良進(jìn)展有關(guān)，但是乳酸調(diào)控腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全清楚［2,4］。

高遷移率族盒蛋白1（HMGB1）在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及化療抵抗等多種生物學(xué)過程有關(guān)［5］。HMGB1可通過主動分泌和被動釋放的方式釋放至胞外，作為信號分子誘發(fā)二次生物學(xué)效應(yīng)［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1通過RAGE介導(dǎo)的常氧糖酵解，增加乳酸生成，活化成纖維細(xì)胞，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［7］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1可調(diào)控周期蛋白和增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖［8］。乳酸通過調(diào)控多個(gè)關(guān)鍵致癌基因和其它涉及代謝重組、細(xì)胞周期調(diào)控和增殖的驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄活性，在腫瘤形成和增殖等過程中發(fā)揮重要作用［4］。鑒于上述研究，我們猜測HMGB1可能參與了乳酸對腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控作用。然而，乳酸能否調(diào)控HMGB1的表達(dá)和釋放、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移尚未見報(bào)道。探明乳酸對HMGB1 表達(dá)和釋放的影響，將為靶向乳酸和HMGB1的抗腫瘤治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

蘆薈苷具有抗炎［9-11］，抗腫瘤［12-14］等作用。我們前期研究已證明，蘆薈苷不僅能夠下調(diào)HMGB1表達(dá)和釋放，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡［13］，還能抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移［15］。蘆薈苷能否通過下調(diào)乳酸誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)和釋放，抑制乳酸誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖和遷移？這些尚未見報(bào)道。解決上述問題將為乳酸在腫瘤增殖和遷移中的分子機(jī)制提供新見解，亦為蘆薈苷的抗腫瘤機(jī)制提供新視角。

1 材料和方法

1.1 試劑、抗體和藥品

蘆薈苷（Aloin，ALO，純度：99.8%,selleck）；乳酸（sigma）；EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（銳博生物科技有限公司）；β-actin,GAPDH,Cyclin D1,Cyclin E1和PCNA抗體購自CST（Beverly）；鼠單克隆抗體E-cadherin,N-cadherin,MMP-2,MMP-9 and HMGB1（Santa Cruz）.辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體購于CST；高糖DMEM 培養(yǎng)基和0.25%的胰酶（Gibco），胎牛血清（Hyclone），青霉素-鏈霉素（碧云天生物技術(shù)公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

胃癌BGC-823細(xì)胞（廣州吉妮歐生物科技有限公司）用含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。細(xì)胞每2～3 d傳代1次。

1.3 EdU實(shí)驗(yàn)

BGC-823細(xì)胞種植于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，至細(xì)胞貼壁后分組進(jìn)行藥物處理。實(shí)驗(yàn)分組如下：對照組、乳酸組、乳酸與不同濃度蘆薈苷聯(lián)合組。細(xì)胞增殖能力采用EdU試劑盒檢測，具體操作按廠家提供的說明書進(jìn)行。熒光倒置顯微鏡觀察結(jié)果并拍照（100×,Olympus,Tokyo,Japan）。EdU陽性染色細(xì)胞（紅色）占總細(xì)胞（藍(lán)色）的百分比表示細(xì)胞增殖率。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

BGC-823細(xì)胞按照1000個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物處理，實(shí)驗(yàn)分組同1.3。藥物作用24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1周。培養(yǎng)板中的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%的結(jié)晶紫室溫染色30 min。最后PBS洗滌細(xì)胞3次，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)各組細(xì)胞克隆數(shù)，并拍照，細(xì)胞數(shù)＞15計(jì)為1個(gè)克隆。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

BGC-823細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞達(dá)到單層融合，用200 μL的滅菌槍頭進(jìn)行劃痕，PBS清洗去除漂浮細(xì)胞。之后按照實(shí)驗(yàn)分組（同1.3）對細(xì)胞進(jìn)行藥物處理。用倒置顯微鏡觀察0 h和24 h的細(xì)胞劃痕愈合情況，Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

分組處理后的BGC-823細(xì)胞（分組同1.3），用無血清的高糖DMEM重懸，取200 μL細(xì)胞懸液放置在小室上層，含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基600 μL放置在小室下層。置于二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。濾膜上層的細(xì)胞用棉棒輕輕擦除，遷移至濾膜下層的細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%的結(jié)晶紫染色30 min之后，放置在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 Western blot

藥物分組處理后的BGC-823細(xì)胞，棄去完全培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次，然后加入細(xì)胞裂解液（含PMSF）冰上裂解細(xì)胞40 min，收集細(xì)胞裂解液，12 000 r/min離心10 min。收集的上清中加入SDS上樣緩沖液煮沸5 min，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，然后用脫脂奶粉室溫封閉1 h。TBST清洗后加入相應(yīng)一抗（CST 公司抗體1∶500稀釋，Santa Cruz公司抗體1∶200稀釋）4 ℃孵育過夜，之后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000稀釋，CST公司產(chǎn)品）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Image J軟件對蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

1.8 ELISA

藥物分組處理后的胃癌細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，HMGB1的釋放量采用ELISA（武漢博美）檢測。具體實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HMGB1干擾質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒購自吉凱基因公司（上海），脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipo3000為賽默飛公司產(chǎn)品。BGC-823細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞達(dá)到50%～60%融合進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染步驟按公司提供的說明書進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 17.0分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩組間比較采用studentt檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘆薈苷減弱乳酸誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖

克隆形式實(shí)驗(yàn)表明，乳酸處理組細(xì)胞克隆數(shù)明顯高于對照組，而蘆薈苷聯(lián)合乳酸處理的胃癌細(xì)胞，克隆數(shù)目與乳酸單獨(dú)處理組相比顯著降低，且蘆薈苷的抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性（圖1）。EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖率發(fā)現(xiàn)，乳酸單獨(dú)刺激的胃癌細(xì)胞與對照組相比，增殖率明顯升高；而蘆薈苷聯(lián)合乳酸組，細(xì)胞的增殖能力與乳酸單獨(dú)處理組相比明顯下降（圖2）。

圖1 蘆薈苷對乳酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞克隆形成的影響Fig.1 Effects of aloin on lactate-induced colony formation by gastric cancer cells (Crystal violet staining).**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs lactate group(n=3).

圖2 蘆薈苷對乳酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of aloin on lactate-induced proliferation of gastric cancer cells(EdU staining,Scar bar:100 μm).**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs lactate group(n=3).

2.2 蘆薈苷抑制乳酸誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移

劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)檢測用于胃癌細(xì)胞的遷移能力，乳酸刺激的胃癌細(xì)胞與對照組相比，劃痕愈合率明顯增加，而蘆薈苷聯(lián)合乳酸處理組細(xì)胞的愈合率卻顯著低于乳酸組。乳酸明顯誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞的遷移，而蘆薈苷聯(lián)合乳酸組，細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯被抑制（圖3、4）。

圖3 蘆薈苷對乳酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞遷移的影響（劃痕實(shí)驗(yàn)）Fig.3 Effects of aloin on lactate-induced migration of gastric cancer cells detected by wound healing assay(Scar bar:100 μm).**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs lactate group(n=3).

圖4 蘆薈苷對乳酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞遷移的影響（Transwell實(shí)驗(yàn)）Fig.4 Effects of aloin on lactate-induced migration of gastric cancer cells(Crystal violet staining,Scar bar:100 μm).**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs lactate group.

2.3 蘆薈苷抑制乳酸誘導(dǎo)的增殖和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)

WB檢測周期蛋白CyclinD1，E1和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的表達(dá)，乳酸能夠增強(qiáng)Cyclin D1，E1 和PCNA的表達(dá)，而蘆薈苷聯(lián)合乳酸處理組能夠濃度依賴性的降低上述蛋白的表達(dá)水平（圖5A）?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP-2，MMP-9及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin的表達(dá)在乳酸的作用下明顯增強(qiáng)，而上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白Ecadherin的表達(dá)則顯著抑制。在蘆薈苷聯(lián)合乳酸處理的細(xì)胞中，蘆薈苷顯著逆轉(zhuǎn)了乳酸誘導(dǎo)的上述蛋白表達(dá)（圖5B）。

圖5 蘆薈苷對乳酸誘導(dǎo)增殖和遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of aloin on lactate-induced expressions of proliferation-and migration-related proteins.A:Expressions of proliferation-related proteins.B:Expressions of migration-related protein.*P＜0.05,**P＜0.01 vs control;#P＜0.05,##P＜0.01 vs lactate group(n=3).

2.4 蘆薈苷抑制乳酸誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)及釋放

乳酸處理胃癌細(xì)胞不同的時(shí)間（0、6、12和24 h），WB檢測胞內(nèi)HMGB1的表達(dá)。HMGB1的表達(dá)在乳酸作用6 h和12 h時(shí)明顯增加，24 h基本降低至本底水平（圖6A）。蘆薈苷聯(lián)合乳酸刺激細(xì)胞6 h，蘆薈苷顯著降低了乳酸誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)（圖6B）。

圖6 蘆薈苷對乳酸誘導(dǎo)HMGB1表達(dá)的影響Fig.6 Effects of aloin on lactate-induced HMGB1 expression.A:Lactate up-regulates the expression of HMGB1.B:Aloin suppresses lactate-induced HMGB1 expression.**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs lactate group(n=3).

2.5 蘆薈苷抑制乳酸誘導(dǎo)的HMGB1釋放

ELISA檢測HMGB1釋放發(fā)現(xiàn)，乳酸單獨(dú)刺激胃癌細(xì)胞6 h和12 h，HMGB1釋放量明顯增加，尤其以6 h最為顯著（圖7A）。蘆薈苷聯(lián)合乳酸作用細(xì)胞6 h，ELISA檢測HMGB1的釋放發(fā)現(xiàn)，與乳酸單獨(dú)處理組相比，蘆薈苷明顯抑制了乳酸誘導(dǎo)的HMGB1釋放（圖7B）。

圖7 蘆薈苷對乳酸誘導(dǎo)HMGB1釋放的影響Fig.7 Effects of aloin on lactate-induced HMGB1 release.A:Release of HMGB1 upon lactate stimulation.B:Aloin inhibits lactate-induced HMGB1 release.**P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs lactate group(n=3).

2.6 敲除HMGB1降低乳酸誘發(fā)的胃癌細(xì)胞增殖和遷移

EdU和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測胃癌的增殖和遷移結(jié)果顯示，HMGB1敲降的胃癌細(xì)胞與陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下降。此外，HMGB1干擾組與陰性對照組相比，乳酸誘發(fā)的增殖與遷移現(xiàn)象亦被有效抑制（圖8A、B）。

圖8 干擾HMGB1降低乳酸誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖（A）和遷移（B）Fig.8 HMGB1 knockdown inhibits lactate-induced proliferation (A) and migration (B) of gastric cancer cells (Scar bar:100 μm).**P＜0.01 vs negative group;##P＜0.01 vs lactate and negative group(n=3).

3 討論

腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解產(chǎn)生的大量乳酸，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，激活致癌信號途徑、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和腫瘤藥物抵抗等［2,16,17］。在癌癥治療中，采用藥物抑制乳酸誘導(dǎo)的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移將為臨床腫瘤的治療提供新思路。已有的研究表明，蘆薈苷聯(lián)合二甲雙胍通過PI3k/Akt/mTOR途徑抑制肝癌細(xì)胞的生長和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬，從而增強(qiáng)抗腫瘤作用［18］。蘆薈苷能否抑制乳酸誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖和遷移尚未見報(bào)道。在本研究中，我們采用蘆薈苷聯(lián)合乳酸共同處理胃癌BGC-823細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不僅乳酸能夠明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，而且該誘導(dǎo)作用均被蘆薈苷顯著抑制。

無論內(nèi)源性還是外源性乳酸均能夠顯著誘導(dǎo)乳腺癌相關(guān)的細(xì)胞周期和增殖基因，如CDΚ4，CDΚ2B，Akt等的轉(zhuǎn)錄［19］。CDΚ4和CDΚ2參與調(diào)節(jié)周期蛋白cyclin D1和cyclin E1的表達(dá)；PCNA是檢測細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)，參與了細(xì)胞周期的調(diào)控［20］；乳酸還能激活腫瘤細(xì)胞蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）［1］。為了探討蘆薈苷抑制乳酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)理，我們檢測了CyclinD1，E1，PCNA和MMPs的表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆薈苷與乳酸聯(lián)合作用組，上述蛋白的表達(dá)水平明顯低于乳酸單獨(dú)刺激組。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤細(xì)胞遷移的分子機(jī)制之一。通過檢測上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin 和Ncadherin發(fā)現(xiàn)，乳酸引發(fā)的EMT亦顯著被蘆薈苷明顯逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果意味著，蘆薈苷可通過下調(diào)周期蛋白，基質(zhì)金屬酶的表達(dá)，抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制乳酸誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖和遷移。

HMGB1在多種腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的增殖、遷移、不良預(yù)后等有關(guān)。我們前期研究中也發(fā)現(xiàn)，蘆薈苷能夠有效抑制HMGB1的表達(dá)和釋放；HMGB1亦能夠調(diào)控周期蛋白和基質(zhì)金屬酶的表達(dá)及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化［8,13］。結(jié)合本研究，我們猜測HMGB1可能在蘆薈苷抑制乳酸誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞增殖和遷移中發(fā)揮一定的作用。我們首先用乳酸刺激胃癌細(xì)胞，WB 檢測HMGB1 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸作用能夠明顯增強(qiáng)HMGB1的表達(dá)。而蘆薈苷聯(lián)合乳酸刺激的胃癌細(xì)胞，乳酸誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)被蘆薈苷顯著抑制。HMGB1不僅在胞內(nèi)發(fā)揮作用，在許多疾病如創(chuàng)傷、炎癥和癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中亦能夠釋放至胞外，作為損傷相關(guān)模式分子誘發(fā)胞內(nèi)二次生物學(xué)效應(yīng)［21］。我們在本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，乳酸刺激胃癌細(xì)胞HMGB1的釋放增加，而蘆薈苷可有效抑制乳酸誘導(dǎo)的HMGB1釋放。為進(jìn)一步證明乳酸可通過調(diào)控HMGB1發(fā)揮增殖和遷移作用，我們在BGC-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HMGB1干擾質(zhì)粒下調(diào)HMGB1的表達(dá)，通過EdU和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖和遷移能力。結(jié)果顯示，HMGB1敲除的胃癌細(xì)胞與陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，乳酸誘導(dǎo)的增殖和遷移均被有效抑制。該結(jié)果進(jìn)一步證明，乳酸可通過HMGB1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。綜合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，蘆薈苷能夠抑制乳酸誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)及釋放，降低乳酸誘發(fā)的胃癌細(xì)胞增殖和遷移。

因此，蘆薈苷可通過降低乳酸誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)和釋放，減弱增殖和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻止上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。該研究為蘆薈苷的抗腫瘤機(jī)制提供了新見解，同時(shí)也為乳酸可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。