陳 旭，申 穎，趙海霞，郭文奇

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院近視眼激光治療中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2第二附屬醫(yī)院急診科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010091

抗青光眼濾過(guò)術(shù)后，結(jié)膜和結(jié)膜下組織的切口誘導(dǎo)了中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等促炎性因子局部浸潤(rùn)、激活成纖維細(xì)胞大量增殖并促進(jìn)彈性蛋白、膠原蛋白等加速合成，導(dǎo)致濾過(guò)道瘢痕化，手術(shù)失?。?］。纖維化過(guò)程由各類(lèi)細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、ⅤEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）等共同參與完成［2］。TGF-β是參與纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵控制因子，在抗青光眼濾過(guò)術(shù)中可使小梁網(wǎng)（TM）皺縮、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積，并增加膠原蛋白、生長(zhǎng)因子的表達(dá)［3］。纖維化過(guò)程中主要由細(xì)胞因子TGF-β及其下游的Smad蛋白共同參與調(diào)控目的基因的表達(dá)TGF-β/Smad 途徑［4］。TGF-β在組織損傷修復(fù)過(guò)程中占主導(dǎo)地位，濾過(guò)性手術(shù)后眼組織促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖活化并大量分泌生長(zhǎng)因子會(huì)導(dǎo)致術(shù)后效果不理想［5］。目前尋找抗青光眼濾過(guò)術(shù)后抑制濾過(guò)道瘢痕化的藥物對(duì)提高手術(shù)成功率尤為重要。吡非尼酮（PFD）是一種廣譜抗纖維化藥物，具有抗炎作用并可以通過(guò)多種途徑抑制纖維化進(jìn)程，包括抑制TGF-β、白介素-1β相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝途徑并減少α-SMA、膠原蛋白和纖連蛋白的表達(dá)［6］，從而減輕炎癥反應(yīng)，抑制成纖維細(xì)胞增殖以及ECM沉積［7］。有研究表明PFD可抑制TGF-β/Smad通路上膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)并抑制成纖維細(xì)胞增殖能力［8］。

吡非尼酮可降低血管通透性、減少炎癥因子表達(dá)產(chǎn)生抗炎作用。作為一種小分子藥物，它能抑制膠原合成，下調(diào)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。吡非尼酮在眼科相關(guān)的纖維增生性疾病的應(yīng)用，可抑制炎性因子遷移、細(xì)胞過(guò)度增殖，改善角膜、結(jié)膜、晶狀體等眼部組織的纖維化進(jìn)程［9］。吡非尼酮治療眼部纖維增生性疾病的主要機(jī)制：涉及抗纖維化、抗炎、抗氧化和抗膠原合成等多個(gè)方面［10］。通過(guò)調(diào)節(jié)各促纖維化通路介質(zhì)，降低TGF-β、TNF-α、ROS（活性氧）和CollagenⅠ等因子的表達(dá)能力，防止或消除組織過(guò)度纖維化沉積［11］。本實(shí)驗(yàn)選用PFD進(jìn)行青光眼濾過(guò)術(shù)后抗瘢痕化的研究，通過(guò)抑制細(xì)胞信號(hào)通路TGF-β/Smad的表達(dá)情況及纖維蛋白的過(guò)分增殖，改善抗青光眼濾過(guò)術(shù)后濾過(guò)道的纖維化程度。本實(shí)驗(yàn)在分子生物學(xué)方面為PFD在臨床眼科增殖性疾病的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 RYTF的原代培養(yǎng)

兔眼Tenons囊組織選材取自健康無(wú)眼疾青紫藍(lán)兔2只（由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心提供，普通級(jí)，批號(hào)20200083/20200084，具有實(shí)驗(yàn)合格證書(shū)），體質(zhì)量為2.0～2.5 kg，月齡8～12周，常規(guī)飼養(yǎng)。無(wú)菌條件下取兔眼Tenons囊組織，在顯微鏡下盡量清除結(jié)膜上皮組織，充分浸洗在含青-鏈霉素的PBS液中，無(wú)菌顯微組織剪剪碎組織塊，向培養(yǎng)皿中加入10 mL完全培養(yǎng)液，吸出含小組織塊和細(xì)胞成分的培養(yǎng)液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。24 h后見(jiàn)細(xì)胞逐漸貼壁生長(zhǎng)。

1.2 RYTF的免疫組化鑒定

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞重懸，將細(xì)胞接種于無(wú)菌24孔板，4%多聚甲醛4 ℃預(yù)冷將細(xì)胞固定20 min。每孔加300 μL過(guò)氧化物酶阻斷液（試劑A），室溫孵育10 min，。封閉30 min，加入一抗，二抗孵育。每孔加SABC 300 μL，37 ℃，30 min。每孔加DAB顯色液（試劑B）300 μL，20 min。蘇木素復(fù)染，1 min；PBS液洗3次，每次5 min，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3 CCΚ-8 法檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)，重懸至細(xì)胞密度約5×103/孔，以后實(shí)驗(yàn)均取此細(xì)胞密度。均勻接種于無(wú)菌96孔板中，在周邊孔中各加入100 μL PBS，分為A-H共7組，每組至少3個(gè)復(fù)孔。I組為對(duì)照組（為細(xì)胞和培養(yǎng)液），H組為調(diào)零組（為基礎(chǔ)培養(yǎng)液）；B-G組（為細(xì)胞和不同濃度的吡非尼酮溶液），濃度分別為0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、1 mg/mL，藥物作用24 h后，吸棄孔內(nèi)液體，分別加入CCΚ-8溶液100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)2 h后，檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)下酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀的每孔吸光度A490nm值。如此重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少5次，綜合各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明吡非尼酮抑制RYTF 增殖的起始作用濃度為0.1 mg/mL，吡非尼酮抑制RYTF增殖的最大無(wú)毒濃度為0.27 mg/mL。取各組吸光度均值并計(jì)算相應(yīng)的抑制率：抑制率=（對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組）/（對(duì)照組-調(diào)零組）×100%；存活率=1-抑制率。

1.4 免疫熒光法檢測(cè)起始作用濃度及最大無(wú)毒濃度吡非尼酮作用后TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，重懸后將細(xì)胞接種于無(wú)菌96孔板，待其貼壁生長(zhǎng)后加入不同濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL），以未加藥孔作為對(duì)照組，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在藥物作用24 h 后固定，通透，封閉。加入TGF-β3（1∶200）、CollagenⅠ（1∶200）、Collagen Ⅲ（1∶200）一抗稀釋液100 μL/孔，4 ℃過(guò)夜。加入熒光二抗（1∶300，避光）100 μL/孔，37 ℃條件下孵育30 min。DAPI染核5 min，避光條件下用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.5 蛋白印跡法檢測(cè)不同濃度吡非尼酮作用后TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)變化情況

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，重懸后將細(xì)胞接種于6孔板，對(duì)照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度吡非尼酮溶液（0.1、0.27 mg/mL）作用24 h。提取可溶性蛋白，吸取可溶性蛋白上清液置于離心管。調(diào)整各組蛋白濃度一致，按上樣量20 μg/孔取蛋白溶液，按1∶4比例將5×蛋白上樣Buffer與樣品混合置于離心管中蓋緊，沸水浴加熱10 min。SDS-PAGE電泳：配置10%分離膠：體積共15 mL（兩塊），配置5%濃縮膠：體積共6 mL（兩塊）加電泳緩沖液，將蛋白樣品加入加樣孔底部。120 Ⅴ恒壓電泳后，全濕電轉(zhuǎn)移后加入一抗TGF-β3、CollagenⅠ、Ⅲ（1∶1000），4 ℃過(guò)夜；TBST洗膜3次。加入抗生物素二抗（1∶1000）置于搖床，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次。避光條件下，滴加顯影液和定影液在PⅤDF膜上，曝光、顯影并拍照記錄，GAPDH一抗（1∶5000）孵育，余同前。

1.6 RT-PCR 檢測(cè)不同濃度吡非尼酮作用后TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)情況

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，對(duì)照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度吡非尼酮溶液（0.1、0.27 mg/mL），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱作用24 h。提取總RNA，檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量、濃度及其完整性，再將各組RNA濃度調(diào)整至基本一致。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，用移液槍輕微混勻樣品并短暫離心，置于冰上。配置PCR反應(yīng)液，采用兩步法設(shè)定反應(yīng)條件，TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及內(nèi)參的引物序列（表1）進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)儀器配套軟件記錄各目的基因以及內(nèi)參基因的Ct值，將各目的基因與內(nèi)參基因相比較，利用2-△△Ct值，并進(jìn)行半定量分析。

表1 PCR反應(yīng)TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及內(nèi)參的引物及序列Tab.1 Primers used for RT-PCR of TGF-β3,collagen I and collagen III

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用方差分析法分析結(jié)果，方差齊時(shí)采用LSD法進(jìn)行多重比較，方差不齊采用Welch檢驗(yàn)，將多個(gè)處理組與對(duì)照組相比時(shí)用DunnettT法，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RYTF的體外培養(yǎng)

取兔眼Tenons囊組織塊體外培養(yǎng)，細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，胞核飽滿(mǎn)，細(xì)胞匯合度良好，生長(zhǎng)走行呈羽毛狀或渦旋狀排列具有方向性（圖1）。

圖1 顯微鏡下體外培養(yǎng)RYTFFig.1 Morphology of cultured rabbit tenon fibroblasts(RTFs)showing adherent cell growth (A) and tightly connected monolayer of the cells (B) (Original magnification:×100).

2.2 RYTF免疫組化鑒定結(jié)果

RYTF波形蛋白染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞漿染呈棕黃色，細(xì)胞核染呈藍(lán)色。對(duì)照組細(xì)胞核和細(xì)胞漿均染呈藍(lán)色（圖2）；RYTF的角蛋白染色呈陰性，細(xì)胞核和細(xì)胞漿均染呈藍(lán)色（圖3）。

圖3 RYTF角蛋白染色結(jié)果Fig.3 Keratin staining results of the RTFs(×100).A:Negative staining for keratin in RTFs,which is the same as the control cells.B:Blue staining in the nuclei and cytoplasm of the RTFs.

2.3 CCΚ-8法檢測(cè)不同濃度吡非尼酮對(duì)RYTF增殖的抑制作用

重復(fù)CCΚ-8實(shí)驗(yàn)法5次，檢測(cè)不同濃度吡非尼酮（0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mg/mL）作用24 h后，RYTF的吸光度A值（表2）。

表2 不同濃度吡非尼酮作用RYTF 24 h后吸光度變化及抑制率Tab.2 Absorbance change and inhibition rate of RTFs treated with pirfenidone at different concentrations for 24 h

2.4 吡非尼酮抑制TGF-β3、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ表達(dá)的免疫熒光結(jié)果

利用免疫熒光法檢測(cè)起始及最適作用濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL）作用于RYTF 24 h 后，各實(shí)驗(yàn)組TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的熒光表達(dá)量與對(duì)照組相比較均明顯減少（圖4）。

圖4 不同濃度吡非尼酮作用于RYTF 后TGF-β3因子的表達(dá)變化Fig.4 Expression changes of TGF-β3 in RTFs after treatment with different concentrations of pirfenidone (Immunofluorescence staining,×200).A1:Control group stained by FITC.A2:Control group stained by DAPI.A3:Merged images of A1 and A2.B1:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.B2:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.B3:Merged image of B1 and B2.C1:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.C2:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.C3:Merged image of C1 and C2.

圖5 不同濃度吡非尼酮作用于RYTF 后Collagen Ⅰ因子的表達(dá)變化Fig.5 Expression changes of collagen I in RTFs after treatment with different concentrations of pirfenidone (×200).A1:Control group stained by FITC.A2:Control group stained by DAPI.A3:Merged image of A1 and A2.B1:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.B2:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.B3:Merged image of B1 and B2.C1:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.C2:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.C3:Merged image of C1 and C2.

圖6 不同濃度吡非尼酮作用于RYTF后Collagen Ⅲ因子的表達(dá)變化Fig.6 Expression changes of Collagen III factor after different concentrations of pirfenidone are treat with RYTF(×200).A1:Control group stained by FITC.A2:Control group stained by DAPI.A3:Merged image of A1 and A2.B1:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.B2:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.B3:Merged image of B1 and B2.C1:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by FITC.C2:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone and stained by DAPI.C3:Merged image of C1 and C2.

2.5 吡非尼酮抑制TGF-β3、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)的結(jié)果

利用Western blot法檢測(cè)起始及最適作用濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL）作用于RYTF 24 h后，各實(shí)驗(yàn)組TGF-β3、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比較均明顯減少（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7）。

圖7 不同濃度吡非尼酮作用于RYTF 24 h后TGF-β3、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ因子的蛋白表達(dá)情況Fig.7 Protein expressions of TGF-β3,collagen I and collagen III in RTFs treated with pirfenidone at different concentrations for 24 h.A:Western blots of the proteins.1:Control group;2:RTFs treated with 0.1 mg/mL pirfenidone;3:RTFs treated with 0.27 mg/mL pirfenidone.B-D:Quantitative analysis of the expression levels of TGF-β3(B),collagen I(C)and collagen III(D)compared with the control group.*P＜0.05,**P＜0.01.

2.6 吡非尼酮對(duì)TGF-β3、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ基因表達(dá)的影響

利用RT-PCR法檢測(cè)起始及最適作用濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL）作用于RYTF 24 h 后，各實(shí)驗(yàn)組TGF-β3、CollagenⅠ和CollagenⅢ的mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比較均明顯減少（圖8）。

圖8 不同濃度吡非尼酮（0.1、0.27 mg/mL）作用于RYTF 24 h后，TGF-β3、Collagen Ⅰ和Collagen ⅢmRNA相對(duì)表達(dá)量的半定量分析圖Fig.8 Semi-quantitative analysis of mRNA expression levels of TGF-β3,collagen I and collagen III in RTFs treated with pirfenidone at 0.1 and 0.27 mg/mLfor 24 h.*P＜0.05,**P＜0.01.

3 討論

非生理性的瘢痕形成過(guò)程，是由各種原因引起的組織損傷愈合后的病理性變化，其基質(zhì)為結(jié)締組織，主要成分為膠原纖維，表層為淺薄的瘢痕上皮結(jié)構(gòu)，與成纖維細(xì)胞和ECM大量沉積有關(guān)，也是大多數(shù)炎癥性疾病的特征性病理改變，這一過(guò)程可以發(fā)生于體內(nèi)多種器官［12］。成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖是導(dǎo)致青光眼濾過(guò)術(shù)后濾過(guò)區(qū)瘢痕化影響手術(shù)效果的主因。TGF-β作為參與纖維化過(guò)程調(diào)控的重要因子，其介導(dǎo)的TGF-β/Smad信號(hào)通路有望在眼組織抗纖維化進(jìn)程中發(fā)揮效能［13］。膠原蛋白在傷口愈合的各個(gè)階段都是關(guān)鍵性成分，創(chuàng)傷發(fā)生后，暴露的膠原與血液接觸，促進(jìn)血小板聚集，活化與創(chuàng)傷相關(guān)的趨化因子，而后膠原成為傷口內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的基本成分，進(jìn)入傷區(qū)的成纖維細(xì)胞合成并分泌CollagenⅠ、CollagenⅢ，構(gòu)成傷口內(nèi)基質(zhì)［14］。所以阻斷膠原蛋白的產(chǎn)生及傳導(dǎo)通路有望抑制過(guò)分纖維化導(dǎo)致瘢痕形成。

持續(xù)的TGF-β過(guò)表達(dá)可引起纖連蛋白沉積于抗青光眼術(shù)后濾過(guò)道以及CollagenⅠ、Collagen Ⅲ增多，導(dǎo)致濾過(guò)道纖維化手術(shù)失敗。在兔眼抗青光眼手術(shù)中，TGF-β可促使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并引起手術(shù)部位結(jié)膜下纖維化［15］。PFD發(fā)揮作用的機(jī)制在于抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程以及細(xì)胞遷移、增殖和收縮能力［16］。在TGF-β家族中TGF-β3因子在各種纖維化疾病中均參與表達(dá)，是參與纖維化過(guò)程的關(guān)鍵因子，是參與調(diào)控修復(fù)創(chuàng)傷瘢痕化的主導(dǎo)因素［17］。研究發(fā)現(xiàn)在纖維化組織周?chē)ㄟ^(guò)產(chǎn)生TGF-β3因子，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及分化，從而幫助組織修復(fù)及瘢痕形成［18］。通過(guò)TGF-β3因子參與誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞多數(shù)增殖能力變強(qiáng)，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞排列不規(guī)整。TGF-β3因子通過(guò)誘導(dǎo)炎癥刺激因子聚積，促使炎癥反應(yīng)加劇，刺激纖維化進(jìn)程導(dǎo)致瘢痕產(chǎn)生［19］。吡非尼酮的抗纖維化作用在臨床上某些領(lǐng)域已經(jīng)得到了認(rèn)可，目前在臨床上已經(jīng)應(yīng)用于控制肝、肺臟等組織纖維化，但在眼科增殖性眼病中的應(yīng)用研究較少。吡非尼酮可通過(guò)抑制TGF-β因子及其通路上蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗纖維化能力［20］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將吡非尼酮應(yīng)用于體外培養(yǎng)兔眼Tenons囊成纖維細(xì)胞（RYTF）研究其抗纖維化的機(jī)制。

吡非尼酮抑制TGF-β3因子的表達(dá)，當(dāng)有外界條件的刺激時(shí)，TGF-β3因子與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合能力降低，使得細(xì)胞傳導(dǎo)通路受到抑制，影響TβR-II-配體-TβR-I 異源三具體復(fù)合物聚合，并在Smad4 協(xié)助RSmads向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移過(guò)程被抑制，使其不能將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，從而抑制了成纖維細(xì)胞的增殖進(jìn)程［21］。表明在纖維化疾病中TGF-β及其下游Smad信號(hào)通路對(duì)瘢痕的產(chǎn)生具有重大影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組TGF-β3熒光表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少，隨吡非尼酮藥物濃度增加，TGF-β3 熒光表達(dá)量降低，表明吡非尼酮通過(guò)對(duì)TGF-β3因子的抑制作用，達(dá)到了抑制組織纖維化進(jìn)程的目的。在蛋白印跡實(shí)驗(yàn)及RT-PCR中TGF-β3表達(dá)量與對(duì)照組相較均顯著減少，隨吡非尼酮藥物濃度增加，TGF-β3表達(dá)量降低。這表明TGF-β3因子在吡非尼酮抑制纖維化過(guò)程中作為通路中的重要影響因子。纖維化過(guò)程中主要由細(xì)胞因子TGF-β及其下游的Smad蛋白共同參與調(diào)控目的基因的表達(dá)TGF-β/Smad途徑［22］。吡非尼酮通過(guò)下調(diào)TGF-β/Smad通路信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制兔眼RYTF增殖［23］。TGF-β3因子持續(xù)過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致纖連蛋白大量沉積，并使CollagenⅠ、CollagenⅢ增多［24］。在創(chuàng)面修復(fù)早期，CollagenⅠ、Collagen Ⅲ在瘢痕形成過(guò)程中起主導(dǎo)作用，Collagen Ⅲ早期大量分泌，隨后CollagenⅠ大量增殖，CollagenⅠ粗大且擴(kuò)張能力強(qiáng)，使組織強(qiáng)度增高纖維化增強(qiáng)［25］。若CollagenⅠ、Collagen Ⅲ增殖遠(yuǎn)超過(guò)正常組織，則會(huì)造成膠原過(guò)度沉積，瘢痕疙瘩產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表達(dá)量均較對(duì)照組明顯減少，表明吡非尼酮能有效降低膠原蛋白表達(dá)，起到抗纖維化作用。吡非尼酮可在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平抑制膠原活化因子產(chǎn)生及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而降低CollagenⅠ和Collagen Ⅲ基因的表達(dá)，有效抑制瘢痕形成［26］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明吡非尼酮可通過(guò)抑制TGF-β3、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ基因和蛋白的表達(dá)，影響TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路，作為吡非尼酮抑制RYTF增殖的可能機(jī)制。綜上所述，吡非尼酮對(duì)體外培養(yǎng)的RYTF增殖具有抑制作用，且可通過(guò)抑制TGF-β/Smad介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮作用，為今后吡非尼酮抗增殖作用在眼部疾病中的進(jìn)一步應(yīng)用提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明吡非尼酮抑制RYTF增殖作用的分子生物學(xué)機(jī)制可能是：通過(guò)抑制TGF-β3分子表達(dá)，影響TGF-β/Smad通路傳導(dǎo)，從而降低CollagenⅠ、Collagen Ⅲ的表達(dá)，起到了抑制RYTF增殖的作用。生長(zhǎng)因子、膠原蛋白表達(dá)下降可能作為抑制RYTF增殖、遷移的直接原因。