王曉慧，王 爽，張 倍，胡 軍

腸球菌是一種革蘭氏陽性球菌，能夠引起泌尿道、血流等多種臨床感染[1-2]，約占醫(yī)院感染或醫(yī)院獲得性感染的10%，是全世界敗血癥的主要原因[3]。海氏腸球菌在臨床上的感染發(fā)生率較低[4]，但病例都為與菌血癥相關(guān)的嚴(yán)重疾病，且感染病例正在增加[5]。耐藥基因cfr、optrA、poxtA均可介導(dǎo)惡唑烷酮類(利奈唑胺)和苯丙醇類(氟苯尼考)耐藥。3種耐藥基因均在多個(gè)地區(qū)不同來源的革蘭氏陽性球菌(主要在葡萄球菌和腸球菌)中被檢出，近年陽性率有所上升，且存在人獸傳播的風(fēng)險(xiǎn)[6-9]。畜牧業(yè)抗生素的殘留能夠?qū)⒓?xì)菌的抗藥性轉(zhuǎn)移給人類[10]。健康人群中攜帶的耐藥基因也可能造成人與人、人向環(huán)境或食物的傳播[11]。本研究通過對來自山東省濰坊市的12個(gè)村的620份糞便樣品進(jìn)行檢測，研究農(nóng)村地區(qū)健康人群中海氏腸球菌的耐藥性和耐藥基因cfr、optrA、poxtA的攜帶率，有助于了解農(nóng)村人群中惡唑烷酮類耐藥基因的流行情況及存在的公共衛(wèi)生隱患。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2017年在山東省濰坊市12個(gè)村對全體無癥狀健康常住村民進(jìn)行采樣，采樣對象最小年齡6歲，最大年齡94歲；其中男性360人，女性260人。共收集到620份無重復(fù)糞便樣本，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃條件保存。

1.2 主要儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (MALDI-TOF-MS) 購自德國Brukert公司； PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；毛細(xì)管凝膠電泳儀購自德國QIAGEN公司；脈沖場凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。腸球菌培養(yǎng)基 (疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂) 基礎(chǔ)、Mueller-Hinton瓊脂 (MHA) 購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氟苯尼考、萬古霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、氯霉素、慶大霉素、利福平、呋喃妥因、美羅培南、左氧氟沙星、紅霉素、克林霉素、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑、阿莫西林，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氨芐青霉素購自北京索萊寶科技有限公司；克拉維酸購自于中國食品藥品檢定研究院；細(xì)菌DNA提取試劑盒產(chǎn)自北京天根生化科技有限公司；PCR反應(yīng)體系、SmaⅠ限制性酶切體系均購自日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定 糞便樣本接種劃線于氟苯尼考 (10 mg/L) 腸球菌選擇性培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選出腸球菌。用無菌取菌環(huán)挑取單個(gè)菌落接種于哥倫比亞血平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，分離純化細(xì)菌后，MALDI-TOP-MS鑒定細(xì)菌種屬。

1.4 藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，糞腸球菌ATCC 29212作為質(zhì)控菌株。測定共14大類15種抗菌藥物的最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration, MIC)，包括：四環(huán)素、萬古霉素、氨芐青霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、利奈唑胺、利福平、呋喃妥因、硫酸慶大霉素、美羅培南、左氧氟沙星、紅霉素、克林霉素、復(fù)方新諾明、阿莫西林/克拉維酸。結(jié)果判定參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)推薦方法 (CLSI 2019) 和歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦方法 (EUCAST 2019)。

1.5 耐藥基因cfr、optrA、poxtA的檢測 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明提取海氏腸球菌DNA。以DNA為模板，使用PCR擴(kuò)增cfr、optrA、poxtA基因，毛細(xì)管凝膠電泳檢測目的條帶。具體引物序列和PCR反應(yīng)條件如表1所示。

表1 耐藥基因cfr、optrA、poxtA引物序列信息Tab.1 Primer sequences for resistance genes cfr, optrA, poxtA

1.6 脈沖場凝膠電泳 使用PFGE對poxtA陽性菌株進(jìn)行分子分型分析。使用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ酶切體系對海氏腸球菌全基因組進(jìn)行酶切，沙門菌H9812經(jīng)過XbaⅠ限制性內(nèi)切酶切后作為分子量參考標(biāo)準(zhǔn)。凝膠成像系統(tǒng)獲得PFGE指紋圖譜，BioNumerics (Version 6.0) 軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離與藥敏試驗(yàn)結(jié)果 12個(gè)村620份糞便樣本共分離獲得29株海氏腸球菌，分離率為4.68%。29株海氏腸球菌對克林霉素和四環(huán)素全部耐藥，對氯霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素、利福平、環(huán)丙沙星、呋喃妥因、慶大霉素、美羅培南、左氧氟沙星的耐藥率分別是96.6% (28/29)、75.9% (22/29)、58.6% (17/29)、37.9% (11/29)、17.2% (5/29)、13.8% (4/29)、10.3% (3/29)、3.4% (1/29)、3.4% (1/29)，對氨芐青霉素和阿莫西林/克拉維酸均敏感。除兩株萬古霉素中介菌株外，未檢測到萬古霉素耐藥菌株。利奈唑胺耐藥率為10.3% (3/29)，在剩余的海氏腸球菌中，有4株利奈唑胺MIC值被判定為中介 (MIC=4 mg/L)，其余22株被判定為對利奈唑胺敏感。多重耐藥菌株檢出率為100%。所有海氏腸球菌耐藥表型見表2。

表2 29株海氏腸球菌耐藥性及耐藥基因的攜帶情況Tab.2 Antibiotic resistance and resistance genes of twenty-nine Enterococcus hiraes

AM：氨芐青霉素；VAN：萬古霉素；TE：四環(huán)素；CIP：環(huán)丙沙星；LNZ：利奈唑胺； CL：氯霉素；GM：慶大霉素；RA：利福平；FD：呋喃妥因；MEM：美羅培南；LVX：左氧氟沙星；ERY：紅霉素；CC：克林霉素；SXT：復(fù)方新諾明；AMC：阿莫西林/克拉維酸。

2.2 耐藥基因cfr、optrA、poxtA檢出結(jié)果 29株海氏腸球菌中有28株攜帶cfr、optrA和poxtA中的一種或兩種耐藥基因，有一株未檢測到以上任何耐藥基因。未檢測到攜帶cfr基因的菌株；optrA陽性菌株有25株，陽性率為86.2% (25/29)；poxtA基因陽性菌株有5株，陽性率為17.2% (5/29)；同時(shí)攜帶optrA和poxtA基因的有2株。具體信息見表2。

2.3 PFGE分型結(jié)果 5株poxtA陽性海氏腸球菌被分為5種PFGE帶型，呈現(xiàn)高度多態(tài)性。結(jié)果如圖1所示：H1和H2屬于一個(gè)分支，帶型相似度為85.7%；H3和H4屬于一個(gè)分支，帶型相似度為88.2%；上述兩個(gè)分支間的相似度為81.1%；H5與H1、H2、H3、H4不在一個(gè)分支，相似度為76.8%。

圖1 5株poxtA陽性海氏腸球菌PFGE聚類圖Fig.1 PFGE cluster of five poxtA-positive Enterococcus hiraes

3 討 論

腸球菌不僅是醫(yī)院感染的常見細(xì)菌，也是獲取、保存、傳播各種耐藥基因的中心樞紐[12]。海氏腸球菌作為腸球菌的一個(gè)種屬，近年來由它引起的人類感染時(shí)有發(fā)生。例如，西班牙報(bào)道的菌血癥肺炎[1]，韓國、土耳其報(bào)道的尿路感染[13-14]，美國、丹麥報(bào)道的心內(nèi)膜炎[15-16]，此外，美國還報(bào)道了一例嬰兒血流感染病例[5]。在既往耐藥基因cfr、optrA、poxtA的研究中，絕大部分集中在糞腸球菌和屎腸球菌，海氏腸球菌研究結(jié)果較少。研究表明，在動(dòng)物源海氏腸球菌存在攜帶多種耐藥的可移動(dòng)遺傳元件，有助于包括poxtA在內(nèi)的耐藥基因在腸球菌中的傳播和持續(xù)存在[17]。

本研究從620份農(nóng)村健康人糞便樣本中分離出29株海氏腸球菌,檢出率4.68%，相比動(dòng)物源海氏腸球菌檢出率低，目前，尚未有人源海氏腸球菌的報(bào)道[17-18]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，海氏腸球菌耐藥情況嚴(yán)重，利奈唑胺耐藥率為10.3% (3/29)，藥敏結(jié)果提示利奈唑胺低水平耐藥。cfr未在本研究中檢出，但optrA和poxtA陽性率高。Hua等[19]報(bào)道了optrA基因在利奈唑胺低水平耐藥機(jī)制中有重要作用。提示海氏腸球菌中，optrA也可能與利奈唑胺低水平耐藥有關(guān)，但需研究證明。PFGE分析顯示海氏腸球菌屬于不同的帶型，表明山東省濰坊市農(nóng)村健康人群糞便攜帶的poxtA陽性海氏腸球菌基因型表現(xiàn)為高度的多態(tài)性，這可能受海氏腸球菌例數(shù)較少的影響。本研究中海氏腸球菌利奈唑胺耐藥率低于Cai等[11]的健康人群糞腸球菌和屎腸球菌利奈唑胺的耐藥率，而optrA陽性率則高于Cai等[11]的研究，這可能與采樣地區(qū)和腸球菌種屬相關(guān)。

綜上所述，本研究中海氏腸球菌耐藥情況嚴(yán)重，耐藥基因攜帶率高，poxtA陽性菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。農(nóng)村地區(qū)常住人口組成特殊，農(nóng)場和屠宰場分布較多，由于知識(shí)水平限制，容易不規(guī)范使用甚至濫用抗生素，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。為防止耐藥菌在農(nóng)村健康人群中的傳播，應(yīng)宣傳規(guī)范用藥，加強(qiáng)對環(huán)境和食品中抗生素和耐藥菌的監(jiān)測。此外，既往研究表明，醫(yī)院病人中利奈唑胺耐藥率和三種惡唑烷酮耐藥基因陽性率較高[20]，因此醫(yī)療機(jī)構(gòu)也應(yīng)做好相關(guān)預(yù)防措施，避免通過醫(yī)療過程造成不同人群間耐藥菌的傳播。

利益沖突：無

引用本文格式：王曉慧，王爽，張倍，等.山東省濰坊市農(nóng)村人群海氏腸球菌惡唑烷酮類耐藥基因流行情況研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2021，37(11)：1017-1021. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.142