焦文豪，徐冰紅，劉 靜，劉培源，嚴(yán)漢池

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

細(xì)胞決策指導(dǎo)生物體的發(fā)育，研究細(xì)胞命運(yùn)選擇發(fā)生的具體機(jī)制至關(guān)重要［1］。目前在不同噬菌體中發(fā)現(xiàn)了復(fù)雜的決策行為，包括細(xì)菌及噬菌體的特異性相互作用［2］、噬菌體子代之間的小分子通訊［3］等行為。其中溫和噬菌體在裂解循環(huán)中產(chǎn)生大量噬菌體顆粒釋放到環(huán)境中［4］，而在溶原循環(huán)中，噬菌體將其DNA 整合到宿主基因組中，與宿主建立潛在的有益關(guān)系［5］，使宿主不受同一噬菌體的感染［6］。近年來，在感染枯草芽孢桿菌的SPbeta 噬菌體中發(fā)現(xiàn)一種新的通訊系統(tǒng)，稱為仲裁通訊系統(tǒng)［7］。仲裁系統(tǒng)本質(zhì)上代表了噬菌體編碼的群體感應(yīng)系統(tǒng)［8］，該系統(tǒng)由3 個噬菌體基因組成：aimP，編碼43 個氨基酸的前體仲裁（arbitrium）肽，分泌到胞外加工成6 個氨基酸的成熟信號肽，再次轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞與AimR 蛋白結(jié)合，解除AimR 蛋白對aimX基因的調(diào)控作用，使噬菌體進(jìn)入溶原周期；aimR，編碼的AimR 蛋白結(jié)構(gòu)上類似于RRNPP 蛋白（革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白）結(jié)構(gòu)，是AimP 編碼肽的胞內(nèi)受體，同時作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子調(diào)控aimX基因的表達(dá)；aimX編碼一個非編碼RNA 作為溶原性的負(fù)調(diào)控蛋白。在整個仲裁系統(tǒng)中，AimR 作為最關(guān)鍵的蛋白對決定噬菌體進(jìn)入溶原裂解周期有重要影響。噬菌體的通訊系統(tǒng)對其自身和與細(xì)菌整體進(jìn)化都起到了重要作用［9］，因此對噬菌體通訊系統(tǒng)的研究受到廣泛關(guān)注。本研究對AimR 蛋白的結(jié)構(gòu)特征、肽作用原理進(jìn)行綜述，希望為進(jìn)一步研究這種蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及利用通訊系統(tǒng)進(jìn)行病害防治提供參考。

1 AimR 蛋白及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征

1.1 AimR 蛋白的結(jié)構(gòu)特征

AimR 蛋白全長386 個氨基酸，由N-末端螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（Helix-turn-helix，HTH）DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-binding domain，DBD，殘基1-73）和專門識別仲裁肽的C-末端的三十四肽重復(fù)序列域（Tet?ratricopeptide repeat，TPR，殘基 79-386）組成，中間由短連接器（殘基 74-78）連接［10］。全長AimR 蛋白由24 個螺旋二級結(jié)構(gòu)組成（圖1）。其中前5 個螺旋形成 DBD 域，其余 α-螺旋分為 8 個 TPR 域和 C 端帽狀限制螺旋。AimR 蛋白在溶液中以具有活性的二聚體形式存在，其二聚作用由C 端限制螺旋介導(dǎo)，其中 L383、L380、L384 和 L386 通過與其他單元的匹配殘基形成范德華相互作用而導(dǎo)致二聚作用。同時AimR 單體通過其N-末端和C-末端之間的相對排列而產(chǎn)生咀嚼狀運(yùn)動［11］。對AimR 蛋白表面靜電勢分析發(fā)現(xiàn)，DBD 表面有一個較大的具有DNA 結(jié)合活性的正電荷區(qū)，可與DNA 結(jié)合介導(dǎo)裂解過程。同時每個AimR 蛋白單體的構(gòu)象略有不同，為AimR 蛋白質(zhì)帶來一定的可塑性［12］。

1.2 AimR-AimP 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征

細(xì)菌表面寡肽通透酶轉(zhuǎn)運(yùn)體（Oligopeptide per?mease transporter，OPP）將仲裁肽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)并提高濃度后AimR 受體與肽結(jié)合，介導(dǎo)噬菌體進(jìn)入溶原周期［13］。在AimR-AimP復(fù)合物結(jié)構(gòu)中（圖1），2個AimR蛋白分子同樣由C端限制螺旋介導(dǎo)形成同型二聚體，TPR 域形成一個深凹的口袋，氨基部分稍微打開，小內(nèi)腔寬度增加，以使每個AimR分子結(jié)合一個AimP六肽（GMPRGA）［14］。同時AimP 結(jié)合引起 AimR N 端構(gòu)象的細(xì)微變化，使AimR 分子形成了一個擴(kuò)展但更嚴(yán)格的DBD域，阻止了AimR蛋白與aimX啟動子區(qū)的結(jié)合，降低了AimR的DNA結(jié)合能力。

在 AimR-AimP 復(fù)合物中，AimP 六肽的 C 端丙氨酸面向口袋內(nèi)部，N 端甘氨酸位于入口點(diǎn)。這些肽與受體的結(jié)合主要通過極性相互作用來協(xié)調(diào)，特別是通過AimR 蛋白家族中保守的Arg、Asp、Gln、Asn 和 Glu 來實(shí)現(xiàn)。在 phi3T 噬菌體中，phAimR 的Asn195、Arg 221、Gln291 和 Asp352 通過鹽橋和氫鍵與SAIRGA 六肽結(jié)合。而在SPbeta 噬菌體中，AimR和AimP 之間的相互作用是由廣泛的氫鍵和疏水接觸網(wǎng)絡(luò)來實(shí)現(xiàn)，AimR 肽主鏈上的氧原子與4 個AimP 殘基形成了氫鍵［12］：Q299AimR 、E300AimR 與G1AimP 氮部分相互作用，N239AimR 與 P3AimP 形成氫鍵，N202AimR 與 G5AimP 相互作用，R228AimR與A6AimP 的氧基接觸，而AimR 的5 個疏水殘基（L205、L242、F276、F362、L363）與 M2AimP 的側(cè)鏈發(fā)生范德華相互作用。此外利用單點(diǎn)突變，證實(shí)了AimR 的 N202、N206、N239、N299、N329 和 D360 殘基對與AimP 結(jié)合有重要作用，這些殘基可能形成噬菌體在溶原裂解之間轉(zhuǎn)換的開關(guān)。

1.3 AimR-DNA 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征

在肽濃度低的時候，AimR 特異性靶向aimP基因下游的51 bp DNA 序列，該序列包含一個31 bp 的回文序列（5ACTTAAATATTAGGTTTTAATAACATC?TAGT3），AimR 與回文序列結(jié)合，激活aimX轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)噬菌體進(jìn)入裂解途徑［14］?；匚男蛄兄?，A、C 堿基是AimR 與DNA 識別的關(guān)鍵，仲裁肽的存在和核苷酸的缺失都會導(dǎo)致回文序列與受體結(jié)合能力明顯降低［15］。在 AimR- DNA 復(fù)合物（圖1）中，整體結(jié)構(gòu)和二聚體排列與AimR 相似，AimR-DNA 復(fù)合物通過典型的HTH 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行DNA 識別，而來自TPR 結(jié)構(gòu)域的殘基與間隔DNA 主鏈相互作用。DNA 結(jié)合型的AimR 二聚體有2 個相互作用面：一個與單獨(dú)AimR 及AimR-肽結(jié)合形式相同，由C 端限制螺旋介導(dǎo)；另一個由每個原體的螺旋6、螺旋7 和loop 7 的殘基 Glu132、Tyr161 和 Asn166 生成，這些殘基彼此形成氫鍵［14］。

AimR 與DNA 的相互作用主要由N 端區(qū)介導(dǎo)，包括廣泛的氫鍵和離子相互作用，產(chǎn)生2 個作用界面［14］。首先，AimR 二聚體的每個原體通過其 DBD 區(qū)域?qū)ΨQ地與DNA 片段的主要溝槽結(jié)合。每個DBD域的識別螺旋α3 面向DNA 軸，并通過殘基Asn30 和Asn32 的側(cè)鏈與主溝的堿基特異性地相互作用。其次，N 端正電荷斑塊中的 10 個殘基（Lys29、Lys43、Thr44、Asn46、Lys77、Thr78、Lys79、Arg82、Asn109、Lys145）參與了 A9、T10、T11、A20、T28、A29、G30、T7′、G8′、T9′、T26、T27′和 A29′的骨架磷酸鹽的配位，構(gòu)成了第二個DNA結(jié)合界面。與肽結(jié)合型AimR相比，DNA 結(jié)合型AimR 組裝的二聚體更為封閉，并且肽結(jié)合引起的構(gòu)想改變縮短了AimR 的DNA 識別螺旋之間的間距，使AimR 不能與DNA 結(jié)合。

2 仲裁通訊系統(tǒng)的作用機(jī)制

2.1 仲裁肽調(diào)控模型

大腸桿菌噬菌體的裂解-溶源決定已被廣泛研究，其主要受感染細(xì)胞的代謝狀態(tài)和感染噬菌體數(shù)量的影響［16］。在λ 噬菌體中，其裂解-溶源決定受噬菌體編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CⅠ、CⅡ和Cro 之間的相互作用以及宿主編碼許多因子的影響［17］。溶原狀態(tài)的主調(diào)控因子是CⅠ阻遏蛋白，它與裂解基因的啟動子結(jié)合并抑制其表達(dá)［18］。當(dāng)噬菌體大量存在時，CⅠ阻遏蛋白抑制噬菌體裂解基因，使噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)。

在仲裁系統(tǒng)中，aimX基因編碼一個短的（51 個氨基酸）開放閱讀框，其后是一個62 個堿基的非編碼 RNA 區(qū)域，在一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)處終止［15］。aimX 基因與CⅠ基因重疊，可以轉(zhuǎn)錄形成順式反義RNA，這種順式反義轉(zhuǎn)錄本可以通過抑制翻譯或刺激RNA降解來沉默重疊的基因［19］。在裂解條件下，aimX通過反式調(diào)控抑制了CⅠ阻遏蛋白的表達(dá)。這種沉默反過來在仲裁肽的存在下得到緩解，從而導(dǎo)致aimX表達(dá)受到抑制。這些結(jié)果為仲裁肽介導(dǎo)的溶源決策提供了一個完整的模型：SPbeta 噬菌體感染細(xì)菌初期，噬菌體表達(dá)aimR和aimP基因。二聚體AimR 蛋白與特定的DNA 結(jié)合，激活aimX編碼一個非編碼RNA 作為溶原周期的負(fù)調(diào)控蛋白，進(jìn)而抑制CⅠ阻遏蛋白表達(dá)，阻斷溶原的發(fā)生。AimP 被釋放到胞外后，被胞外蛋白酶加工成成熟的仲裁肽，經(jīng)過幾個感染周期后，仲裁肽會在環(huán)境中積累。通過OPP 通道內(nèi)化到鄰近細(xì)胞中。在后期階段，噬菌體會感染胞內(nèi)肽濃度較高的細(xì)胞，這種情況下，AimR 與仲裁肽結(jié)合，阻止了aimX的表達(dá)。隨后，噬菌體CⅠ阻遏蛋白表達(dá)并與裂解基因的啟動子結(jié)合，抑制其表達(dá)并進(jìn)入穩(wěn)定的溶原狀態(tài)（圖2）。

2.2 仲裁肽的特異性結(jié)合影響決定

仲裁系統(tǒng)已經(jīng)在100 多種噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，仲裁肽多為6 肽，在個別噬菌體中也可長達(dá)10 個氨基酸［20］。仲裁肽的序列不盡相同，其中80%的仲裁肽分布在6個大家族中（GMPRGA、GVVRGA、GFGRGA、SASRGA、GFTVGA、SAIRGA），其高度保守的 RGA C-端區(qū)域和可變的N 端區(qū)域解釋了肽受體的特異性，保守的RGA 基序和主鏈與受體蛋白的結(jié)合通過AimR 中完全保守的 N202、R228 和 T236 殘基來實(shí)現(xiàn)［15］。其中Ala 側(cè)鏈夾在2 個保守的疏水殘基之間，Arg 與嚴(yán)格保守的D360 形成鹽橋。肽的N 端部分賦予了肽的可變性，AimR 殘基（SPbeta 中的 A273 和M296）與肽的第三位相互作用是高度可變的。并且肽的N 端部分通過與受體中高度保守的殘基相互作用進(jìn)行錨定，確保了受體可讀出肽的正確構(gòu)象。

由于肽的可變性，仲裁肽只與來自同一噬菌體的相應(yīng)AimR 受體特異性結(jié)合，觸發(fā)裂解-溶原轉(zhuǎn)化。成熟的SPbeta AimP 仲裁肽為GMPRGA，其序列與phi3T 的SAIRGA 肽不同。GMPRGA 肽沒有顯示出與phi3T AimR 受體的特異性結(jié)合，GMPRGA 肽也只促進(jìn)SPbeta 的溶原，不影響phi3T 的溶原。這些結(jié)果表明，序列特異性肽指導(dǎo)噬菌體溶原發(fā)生在特異性噬菌體中。雖然仲裁肽的存在對噬菌體的溶原作用有顯著影響，但這種影響不是絕對的［21］。即使肽濃度高的情況下，溶原發(fā)生的概率只是明顯升高，并不是全部溶原化；同樣，在缺乏肽的情況下，噬菌體也不會發(fā)生專性裂解。因此，噬菌體有一個隨機(jī)、獨(dú)立溶菌化的趨勢。

2.3 仲裁肽影響AimR 受體的構(gòu)象改變

AimR 的結(jié)構(gòu)具有內(nèi)在的靈活性，影響了HTH結(jié)構(gòu)域在二聚體中的相對分布，當(dāng)與AimP 結(jié)合后AimR 表現(xiàn)出更緊密的構(gòu)象，引起超螺旋螺距的減小。AimP 結(jié)合引起的閉合運(yùn)動減少了TPR 域N 端和C 端之間的距離，允許2 個子域殘基之間形成新的相互作用，從而穩(wěn)定肽結(jié)合構(gòu)象［15］。同單獨(dú)AimR 和 DNA 結(jié)合形式比較，AimR-AimP 二聚體中2 個單體幾乎完全相同，表明肽與TPR 域相互作用引起的封閉結(jié)構(gòu)使AimP 穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，迫使TPR 域N 端C 端的接近來實(shí)現(xiàn)這些交互。此外，AimR 蛋白的N 端和C 端在不同的構(gòu)象中幾乎是相同的，而連接區(qū)域起著鉸鏈的作用，表明AimR 閉合更像是一種剛體運(yùn)動，同時序列分析也表明，該連接子在AimR 受體中高度保守，因此連接區(qū)域一定是AimP誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件。

在沒有仲裁肽的情況下，二聚體AimR 表現(xiàn)出動態(tài)的開放和封閉構(gòu)象，分別有利于與肽和DNA 結(jié)合。肽結(jié)合后，AimR 處于開放狀態(tài)，很難過渡到封閉狀態(tài)。然后，肽抑制AimR 與目標(biāo)DNA 結(jié)合。同樣，這種構(gòu)象轉(zhuǎn)變抑制機(jī)制在不同的噬菌體中也存在差異［22］。在phi3T 噬菌體中，肽結(jié)合可以完全破壞AimR 蛋白的二聚體狀態(tài)，導(dǎo)致其向單體狀態(tài)轉(zhuǎn)移，降低其DNA 結(jié)合活性。在SPbeta 噬菌體中，AimR 與AimP 結(jié)合后，發(fā)生構(gòu)象改變進(jìn)而失去DNA結(jié)合活性，但其二聚體狀態(tài)并未改變，肽實(shí)際上通過鎖定AimR 二聚體的形式來促進(jìn)溶源。這意味著在SPbeta 噬菌體的仲裁系統(tǒng)中，AimP 通過一種不同于phi3T 噬菌體中相應(yīng)機(jī)制的機(jī)制來滅活A(yù)imR，說明噬菌體中至少存在2 種不同的寡聚化調(diào)控機(jī)制。

2.4 仲裁肽影響AimR 受體與DNA 的結(jié)合

AimR 在無肽狀態(tài)下是一種轉(zhuǎn)錄激活子，AimR的N 端部分對DNA 靶向至關(guān)重要，同時二聚體的形成對其DNA 結(jié)合特性也十分重要。AimR 的DNA結(jié)合活性，實(shí)際是由仲裁肽調(diào)節(jié)。肽施加的剛性阻止了AimR 與DNA 的結(jié)合，也證實(shí)了AimR 的可塑性對DNA 結(jié)合至關(guān)重要，AimR 是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活的DNA 結(jié)合蛋白，它們在與肽結(jié)合后失去活性，對SP?beta 噬菌體的裂解溶原決策是至關(guān)重要的。

在仲裁系統(tǒng)中，AimR 在不存在仲裁肽的情況下作為二聚體與噬菌體DNA 結(jié)合，是aimX 的轉(zhuǎn)錄激活體，激活aimX 轉(zhuǎn)錄aimX 通過順反義機(jī)制直接抑制CI 抑制因子，阻斷溶原的發(fā)生；反過來aimX 的沉默會導(dǎo)致溶原增加。AimR 與仲裁肽結(jié)合后，失去其DNA 結(jié)合活性，進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)，以確定噬菌體溶原裂解過程的轉(zhuǎn)變［15］。仲裁肽影響AimR 受體與DNA 的結(jié)合是通過改變AimR 受體的構(gòu)想來實(shí)現(xiàn)的，噬菌體phi3T 的AimR 受體在結(jié)合了仲裁肽SAIRGA 后，其低聚物狀態(tài)從二聚物變?yōu)榉腔钚詥误w，抑制aimX 轉(zhuǎn)錄并導(dǎo)致溶原性。而添加SPbeta GMPRGA 肽并沒有導(dǎo)致SPbeta AimR 寡聚狀態(tài)的改變，AimR 蛋白仍為二聚體狀態(tài)，但AimP 結(jié)合引起AimR N 端構(gòu)象的變化，使 AimR 蛋白不能與 aimX 啟動子區(qū)結(jié)合，aimX 沉默進(jìn)入溶原途徑。不同構(gòu)象改變也說明了肽與其受體在仲裁系統(tǒng)中的高度特異性，都導(dǎo)致2 個菌株偏向溶原。

3 AimR 蛋白屬于 RRNPP 家族

群體感應(yīng)現(xiàn)象是細(xì)菌調(diào)節(jié)自身密度的重要方法，其中起重要作用的是RRNPP 蛋白家族［23］。RRNPP蛋白家族是重要的胞質(zhì)肽感應(yīng)調(diào)節(jié)因子，包括5 個代表性成員，即Rap、Rgg、NprR、PICR 和PrgX，它們在控制細(xì)菌群體感應(yīng)中有重要作用［24］。通過群體感應(yīng)，細(xì)菌能夠產(chǎn)生和響應(yīng)小信號分子參與細(xì)胞間交流，可通過細(xì)菌毒力因子表達(dá)、細(xì)菌結(jié)合、生物膜形成、孢子形成、抗生素合成等多種生理過程來調(diào)節(jié)種群密度，對維持細(xì)菌的菌群數(shù)量有重要作用［25］。

與在仲裁系統(tǒng)中一樣，RRNPP 家族由一個細(xì)胞質(zhì)受體和一個短的（5~10 個氨基酸）信號肽組成［26］。RRNPP 家族調(diào)節(jié)因子與信號肽結(jié)合激活后，肽段通過調(diào)節(jié)RRNPP 受體的低聚物狀態(tài)或構(gòu)象的改變來發(fā)揮作用［27］。例如，NprX 與對應(yīng)肽的結(jié)合促進(jìn)了二聚體NprR 向四聚體的轉(zhuǎn)化，四聚體專門針對DNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)［28］。除了Rap亞家族外，所有的RRNPP成員都有一個N 端HTH 基序與DBD 域的雙域結(jié)構(gòu)和一個 C 端的肽結(jié)合域［29］。RRNPP 家族成員的結(jié)構(gòu)特征表明肽結(jié)合域是由TPR 域組成，該重復(fù)序列采用超螺旋折疊，內(nèi)凹槽為肽結(jié)合處。與仲裁系統(tǒng)類似，肽與TPR 域的結(jié)合調(diào)節(jié)RRNPP 受體的轉(zhuǎn)錄活性。這些相似性表明，仲裁系統(tǒng)是RRNPP 家族的成員，具有相似的作用機(jī)制。結(jié)構(gòu)上也顯示短肽結(jié)合在AimR 的螺旋空腔里面，表明AimR 屬于RRNPP蛋白家族。雖然AimR 屬于RRNPP 蛋白家族，AimR對GMRPGA 肽的調(diào)節(jié)方式與經(jīng)典的RRNPP 轉(zhuǎn)錄因子相似，但與不包括側(cè)鏈特異性接觸的RRNPP 與信號肽的相互作用不同，它們之間的調(diào)節(jié)機(jī)制也存在一定差異。

4 小結(jié)與展望

仲裁系統(tǒng)的研究說明肽通訊對噬菌體和細(xì)菌的協(xié)同進(jìn)化有重要作用，表明噬菌體群體感應(yīng)是生物學(xué)中值得研究的重要方面。仲裁系統(tǒng)中，3 個基因各司其職，保障了噬菌體高效合理的生存。其中胞內(nèi)肽濃度是噬菌體進(jìn)入溶原或裂解途徑的關(guān)鍵，而肽序列具有多樣性，不同的噬菌體之間通過不同的分子語言向同類傳遞信息，表明了噬菌體特異性的進(jìn)化驅(qū)動力，為深入了解病毒和微生物社會網(wǎng)絡(luò)的分子通信機(jī)制提供了思路。目前具備仲裁系統(tǒng)的噬菌體依賴特定細(xì)菌，只侵染具有OPP 通道和胞外蛋白酶的芽孢桿菌，表明仲裁系統(tǒng)只是噬菌體通訊系統(tǒng)的一部分，可能只存在于感染特定細(xì)菌的噬菌體中。同時噬菌體構(gòu)成了很大的社會網(wǎng)絡(luò)，有關(guān)仲裁系統(tǒng)的研究對了解整個噬菌體的群體感應(yīng)有重要借鑒意義，也為其他方面的研究打開一些思路。例如，仲裁系統(tǒng)為噬菌體提供了一定機(jī)制來估計(jì)感染的數(shù)量，而這種策略是否存在于感染真核生物的病毒中來介導(dǎo)休眠或裂解，其他基因是否參與了噬菌體的群體感應(yīng)等，還有待考證；噬菌體中是否存在串?dāng)_現(xiàn)象等也有待研究。相信隨著仲裁系統(tǒng)的深入研究，這些問題會得到解答。