梁 艷 趙雪瑩 白 雪 劉德強 張 妍 潘 朋

(齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院 齊齊哈爾 161006)

黑皮油松(Pinustabulaeformisvar.mukdensis)為油松的變種，抗逆性強，具有耐干旱和瘠薄土壤、耐寒、防風、抑菌能力強等優(yōu)良特性，是我國北方兼具經(jīng)濟價值與生態(tài)價值的造林樹種(Wangetal.， 2019)。黑皮油松樹形俊美、枝虬若龍，尤其是冬態(tài)更能充分體現(xiàn)北方地域性的植物景觀特色，已被廣泛應(yīng)用于我國北方園林綠化中(陳新宇等， 2019)。由于黑皮油松生命周期較長，且存在種子結(jié)實率低、子代優(yōu)良性狀降低等問題(Huietal.， 2016)，導(dǎo)致嫁接與種子的傳統(tǒng)良種繁育方式難以滿足市場需求，而離體快繁技術(shù)能顯著加速樹種品質(zhì)改良并提高良種苗木的生產(chǎn)能力(高潔等， 2019； 宋躍朋等， 2019)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與其他木本植物類似(Bongaetal.， 2010)，以黑皮油松的休眠芽作為外植體進行離體培養(yǎng)褐變較嚴重，類似的褐變問題在歐洲赤松(Pinussylvestris)等松屬(Pinus)植物的離體培養(yǎng)中也普遍存在(Andersoneetal.， 2005)，極大地影響了其離體培養(yǎng)的成功率，制約了其優(yōu)質(zhì)組培苗的快速繁殖與推廣應(yīng)用。因此如何有效抑制黑皮油松外植體褐變是組培生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。

大量研究表明，培養(yǎng)基中添加聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、維生素C(VC)、硝酸銀(AgNO3)和活性炭(active carbon，AC)等抗氧化劑以及酚類物質(zhì)的吸附劑可達到抑制外植體褐化的目的。在葡萄(Vitisvinifera)(饒慧云等， 2015)、天女木蘭(Magnoliasieboldii)(高紅兵等， 2017)、水曲柳(Fraxinusmandshurica)(彭春雪等， 2019)等材料的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加適宜濃度的PVP對抑制外植體褐化效果顯著。組培中褐變多由酶促褐變引起，酚類化合物是褐變發(fā)生的主要底物，酚類物質(zhì)再經(jīng)多種氧化酶催化后形成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)通過聚合產(chǎn)生褐色物質(zhì)，酶、底物和氧氣是引起外植體褐變的3個基本條件。酚類物質(zhì)的含量與種類直接影響著褐化的程度，相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)與褐化有關(guān)的酚類物質(zhì)主要包括咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、綠原酸、兒茶酚和對羥基苯甲酸等(Babbaretal.， 1986； Cosetengetal.， 2010)。相對于草本植物，酚類物質(zhì)含量較髙的木本植物的褐化問題尤為嚴重，成為制約其離體培養(yǎng)及快速繁殖成功與否的重要因素(Xuetal.， 2011； Wangetal.， 2014)。此外，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)等也與褐化過程相關(guān)(Wangetal.， 2014)。

目前黑皮油松愈傷組織抗褐化研究已有相關(guān)報道(付雙彬等， 2017)，但對于其休眠芽外植體離體培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及抗褐化處理過程中相關(guān)酶活性與酚酸類物質(zhì)含量變化的研究尚未見報道。鑒于此，本研究以成年黑皮油松的休眠芽為外植體，分析抗褐化劑PVP處理對其褐變及萌發(fā)的影響，篩選適宜的PVP處理濃度，在此基礎(chǔ)上分析抗褐化過程酚酸類物質(zhì)及PPO、POD、PAL酶活性的動態(tài)變化，確定引起褐化現(xiàn)象的主要酚酸類物質(zhì)，探討PVP處理過程中酚酸類物質(zhì)及相關(guān)酶活性與其褐化的相關(guān)性，為黑皮油松組織培養(yǎng)過程中褐變這一瓶頸問題的解決提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，進而為黑皮油松高效植株再生體系的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和培養(yǎng)方法 2018年3月10日從齊齊哈爾大學校園的成年黑皮油松上采集生長健壯、無病蟲害、芽體飽滿的休眠葉芽作為外植體。葉芽在洗潔精溶液中清洗干凈后流水下沖洗2 h，超凈工作臺上采用0.1%的HgCl2浸泡6 min，無菌水沖洗5次，每次5 min(帶有振蕩)； 無菌器械剝?nèi)パ亏[(圖1A)，將葉芽橫切成0.5～0.7 cm厚的薄片，按照形態(tài)學方向豎直接種到培養(yǎng)基上(圖1B)。

圖1 PVP處理對黑皮油松外植體褐化的影響

1.2 PVP處理試驗 DCR基本培養(yǎng)基(Guptaetal.， 1985)中分別添加不同質(zhì)量濃度的PVP(100、300、500、800、1 000、1 500、2 000 mg·L-1)，分別記為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7，以不添加任何抗褐化劑為對照(CK)。其余添加成分相同，分別添加30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂、2.0 mg·L-16-BA，pH5.8。培養(yǎng)條件： 溫度(25 ± 2)℃，光照每天16 h，光照強度1 500～2 000 lx。每個處理培養(yǎng)30個外植體，重復(fù)3次。接種后每隔4天觀察外植體的褐化情況，培養(yǎng)32天統(tǒng)計外植體的褐化率及休眠芽萌發(fā)率。

采用目視觀察確定褐化程度，將褐化等級劃分為3級： “+” 外植體輕度褐化，周圍培養(yǎng)基色澤淺； “++” 外植體中度褐化，周圍培養(yǎng)基顏色加深； “+++” 外植體褐化嚴重，周圍培養(yǎng)基顏色深。

褐化率=(褐化的外植體數(shù) /接種的外植體總數(shù))× 100%；

萌發(fā)率=(萌發(fā)的外植體數(shù) /接種的外植體總數(shù))× 100%。

1.3 酶活性和酚酸含量的測定 1)取樣 分別于接種后0、4、8、12、16、20、24、28、32天選取1 500 mg·L-1PVP處理與CK處理下典型性的黑皮油松外植體，液氮速凍后-80 ℃保存用于酶活性與酚酸含量的測定。

2)酶活性的測定 PPO活性測定參照朱廣廉等(1990)方法，PAL活性測定參照Solecka和Kacperska(2003)方法，POD活性測定參照李合生(2003)的愈創(chuàng)木酚法，3種方法均略作修改。

3)酚酸含量的測定 參考Alonso-Salces等(2005)方法略加改動。稱取冷凍樣品1.0 g，加入10 mL 50%甲醇水溶液，研磨制備勻漿液，50 ℃ 40 kHz超聲40 min，重復(fù)提取2次，合并提取液； 將提取液8 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，剩余上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃減壓濃縮，2 mL甲醇潤洗殘渣，50%甲醇定容至5 mL，上機測試。測試條件： 超高效液相色譜儀(型號 1290，美國安捷倫公司生產(chǎn))； 二極管陣列檢測器(型號1290 Infinity II)； 色譜柱為Eclipse Plus C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)。使用A和B雙泵系統(tǒng)，流速0.5 mL·min-1，柱溫30 ℃，波長280 nm，進樣量1 μL。流動相A為2%(體積分數(shù))乙酸水溶液，流動相B為甲醇溶液。采用梯度洗脫： 0～2 min，A100%～100%，B0～0； 2～3 min，A100%～95%，B0～5%； 3～4 min，A95%～85%，B5%～15%； 4～5 min，A85%～75%，B15%～25%； 5～7 min，A75%～65%，B25%～35%； 7～9 min，A65%～50%，B35%～50%； 9～12 min，A50%～100%，B50%～0。甲醇和乙酸均為色譜純，沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶酚、香豆酸、對羥基苯甲酸和阿魏酸7種標準品純度≥99%(Sigma公司生產(chǎn))。定量方法參照孫洪圳等(2012)，并略作改動。每個樣品重復(fù)3次進樣測定，測定結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理 試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007、SPSS 17.0、Origin 8.5軟件進行分析處理，鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan)進行顯著性檢驗，圖中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗褐化劑PVP對黑皮油松休眠芽外植體褐化和萌發(fā)的影響 以未添加抗褐化劑的外植體為對照(CK)，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的抗褐化劑PVP，于處理32天統(tǒng)計外植體褐化率與萌發(fā)率(表1)。結(jié)果表明，隨著PVP處理濃度的增加，褐化率與褐化程度均呈現(xiàn)先降后增的規(guī)律性變化，萌發(fā)率則先增后降，說明PVP處理可以有效抑制黑皮油松休眠芽外植體的褐化，并促進其萌發(fā)。當PVP濃度為1 500 mg·L-1(P6)時，褐化程度最輕，褐化率最低(25.56%)，萌發(fā)率也最高(37.78%)，整體來看顯著優(yōu)于其他處理； 當PVP增至2 000 mg·L-1時，其抑制褐化與促進萌發(fā)效果再次降低。綜合來看，300～1 500 mg·L-1PVP處理可以有效抑制黑皮油松休眠芽外植體的褐化，其中1 500 mg·L-1效果最好。培養(yǎng)32天結(jié)束時，對照休眠芽由上至下整體變?yōu)樯詈稚?，幾乎全部死?圖1C)，而PVP處理的外植體褐化程度明顯輕于對照組，長勢也明顯優(yōu)于對照組(圖1D)。

表1 不同濃度PVP處理對外植體褐化和芽萌動的影響①

為進一步明確PVP抑制黑皮油松外植體褐化的時間效應(yīng)，對PVP處理不同時間節(jié)點外植體的褐化情況進行統(tǒng)計分析(圖2)。隨著處理時間的增加，對照與所有PVP處理外植體的褐化率均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢。具體來看，外植體均在培養(yǎng)4天時開始出現(xiàn)褐化，隨后隨著培養(yǎng)時間的增加，褐變的外植體數(shù)量逐漸增加。培養(yǎng)8天時，除P7處理外，其余PVP處理的褐化率均顯著低于對照，表明PVP(100～1 500 mg·L-1)處理從第8天開始表現(xiàn)出明顯的抑制黑皮油松外植體褐化的作用； 8～12天所有處理外植體褐變愈發(fā)嚴重，褐化率增加幅度大，其中800 mg·L-1PVP處理的褐化率從14.44%急劇增加到47.78%； 除P2、P6處理外，對照與其他5個PVP處理的外植體均在20～24天時褐化率達到峰值，隨后趨于穩(wěn)定。

圖2 PVP處理不同時間對黑皮油松外植體褐化的影響

2.2 PVP處理過程相關(guān)酶活性的動態(tài)變化 組培褐變是一個復(fù)雜的生理代謝過程，為了更清楚地了解抗褐化劑PVP減緩黑皮油松離體外植體褐化的機理，進一步以1 500 mg·L-1PVP處理(最佳處理)不同時間節(jié)點的黑皮油松外植體為材料，以不添加PVP的外植體為對照，分析PPO、POD、PAL 3種抗氧化酶活性的變化特征(圖3)。

1) PPO活性的動態(tài)變化 隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組PPO活性呈現(xiàn)“升—降—升—降”的交替式變化，0～8天 PPO活性有小幅增加，8～12天急劇增加，12天出現(xiàn)峰值，活性為8.75 U·g-1min-1，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)，為PVP同樣處理天數(shù)下的3.5倍； 12～20天PPO活性呈現(xiàn)遞減的變化趨勢， 20～24天再次增加，24天活性為5.83 U·g-1min-1，隨后再次降低。對照組PPO活性在8～12天和20～24天急劇增加，這2個時間點恰好是外植體褐變愈發(fā)嚴重的時期。與對照相比，PVP處理的外植體PPO活性在整個培養(yǎng)周期內(nèi)始終處于相對較低的水平(1.25～2.92 U·g-1min-1)，從處理后4 天開始PPO活性顯著低于對照(圖3A)。上述結(jié)果表明PPO活性變化與黑皮油松外植體褐化密切相關(guān)，PVP處理可抑制PPO活性的升高。

2) PAL活性的動態(tài)變化 在0～32天內(nèi)，CK處理PAL活性呈現(xiàn)“升—降—升—降—升—降”的交替式變化，0～12天PAL活性小幅增加，12天活性52.08 U·g-1min-1，12～16 天大幅降低，16～20天急劇增加， 20天達到峰值(148.33 U·g-1min-1)，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)， 20～32天PAL活性再次出現(xiàn)多次波動，28天出現(xiàn)小高峰(活性為65.42 U·g-1min-1)。與對照相比，PVP處理PAL活性在整個處理周期內(nèi)一直處于相對較低的水平，活性為4.58～31.67 U·g-1min-1， 20天時活性最高(31.67 U·g-1min-1)，但仍顯著低于對照20天的活性(P< 0.05)(圖3B)。由此看出，與對照相比，PVP處理從第8天開始PAL活性明顯受到抑制，觀察發(fā)現(xiàn)PVP處理表現(xiàn)出明顯抑制黑皮油松外植體褐化的時間點也是從第8天開始，褐變嚴重的對照PAL活性顯著高于外植體褐變程度輕的PVP處理，因此推測PVP處理可能通過抑制PAL活性來阻止黑皮油松外植體發(fā)生褐變。

3) POD活性的動態(tài)變化 隨著培養(yǎng)時間的延長，對照外植體第4天時POD活性顯著增加，4～16天POD活性下降，16～20天急劇增加， 20天出現(xiàn)峰值，活性為1 419.12 U·g-1min-1，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)，隨后POD活性再次降低直至培養(yǎng)結(jié)束。與對照相比，PVP處理的外植體POD活性呈現(xiàn)不同的變化趨勢，8天時出現(xiàn)第1個小高峰(488.33 U·g-1min-1)，隨后降低，16～28天POD活性再次提高(717.08～818.75 U·g-1min-1)，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)，28～32天時活性再次降低(圖3C)。整體來看POD活性與褐變數(shù)據(jù)變化的規(guī)律不明顯，可能由于取樣持續(xù)時間歷時較長，培養(yǎng)基成分和萌發(fā)生長階段等多因素影響導(dǎo)致POD活性測定結(jié)果呈現(xiàn)波動式變化。

2.3 PVP處理過程中酚酸類物質(zhì)含量的動態(tài)變化1) 綠原酸含量動態(tài)變化 與對照相比，PVP處理的外植體中綠原酸含量在整個培養(yǎng)周期始終處于較高的水平，從第4天開始直至培養(yǎng)結(jié)束均顯著高于對照，且整體呈現(xiàn)“降—升—降—升”的交替式變化，PVP處理0～12天綠原酸含量逐漸降低，隨后再次提高，16天出現(xiàn)小高峰(含量為1.875 μg·mL-1)，但顯著低于0 天的含量，16～20天再次降低后有小幅度的增加，隨后保持穩(wěn)定(圖4A)。上述研究結(jié)果表明PVP處理從第8天開始保護外植體內(nèi)綠原酸不被氧化，進而抑制黑皮油松外植體發(fā)生褐變。

2) 香豆酸含量動態(tài)變化 對照與PVP處理過程中香豆酸含量變化出現(xiàn)多次波動，但整體來看對照與PVP處理香豆酸含量較為接近，始終維持在較低的水平(0.312～0.825 μg·mL-1)，據(jù)此推測PVP處理抑制黑皮油松外植體褐化的作用可能與香豆酸關(guān)系較小。具體來看，對照處理0天香豆酸含量最高(0.825 μg·mL-1)，除與20天差異不顯著外，均顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)，0～12 天香豆酸含量逐漸降低，12～20 天逐漸增加，隨后再次降低。PVP處理香豆酸含量呈現(xiàn)“降(0～8天)—升(8～16天)—降(16～20天)—升(20～24天)—降(24～32天)”交替式變化(圖4B)。

3) 阿魏酸含量動態(tài)變化 對照外植體中阿魏酸含量在0～16 天遞減，16～32天小幅波動； 而PVP處理則出現(xiàn)多次波動，呈現(xiàn)“降(0～12 天)—升(12～16 天)—降(16～20 天)—升(20～24 天)—降(24～32 天)”交替式變化。0～12 天PVP處理與對照阿魏酸含量較為接近，變化趨勢也類似； 但16～32 天PVP處理阿魏酸含量顯著高于對照，24 天時PVP處理外植體阿魏酸含量最高(5.433 μg·mL-1)，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)(圖4C)。據(jù)此推測PVP處理抑制外植體褐變可能主要是通過保護綠原酸和阿魏酸不被氧化而起作用，其中對綠原酸在全程起到保護作用，對阿魏酸的保護作用僅在中后期(16～32 天)。

3 討論

3.1 PVP處理黑皮油松休眠芽外植體的抗褐化效果 PVP作為一種無機吸附劑，通過吸附外植體釋放出來的酚類物質(zhì)，阻止酚類物質(zhì)不被氧化進而達到抑制外植體褐變的目的，因此在植物組織培養(yǎng)中廣泛用于抑制褐化，而且效果顯著(Babbaretal.， 1986； 饒慧云等， 2015； 高紅兵等， 2017； 彭春雪等， 2019)。本研究結(jié)果表明，300～1 500 mg·L-1PVP處理可以有效抑制黑皮油松休眠芽外植體的褐化，并促進休眠芽啟動萌發(fā)。葉睿華等(2018)的研究也發(fā)現(xiàn)PVP對杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)原球莖褐化具有抑制作用，并能提高原球莖增殖率。本研究篩選出PVP最佳處理濃度為1 500 mg·L-1，說明培養(yǎng)基中添加適宜濃度的PVP能有效吸附外植體釋放的酚類物質(zhì)，阻止酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì)，從而達到抑制外植體褐化的效果，但當PVP處理濃度增至2 000 mg·L-1時，防褐化效果顯著降低，說明高濃度的PVP會影響其抑制褐化作用的發(fā)揮。葡萄愈傷組織的繼代研究中也發(fā)現(xiàn)2 000 mg·L-1PVP有助于抑制褐化，但增至3 000 mg·L-1時褐化率再次增加(饒慧云等， 2015)，分析可能是由于PVP濃度過高導(dǎo)致其吸附酚類物質(zhì)的同時也吸附培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，進而影響了植物對有益物質(zhì)的吸收和利用，最終影響抗褐化效果(Teixeriaetal.， 1994)。

3.2 主要酚酸、酶活性與外植體褐化之間的關(guān)系 褐化是復(fù)雜的生化過程，由酶引起細胞內(nèi)的氧化褐變是組培中外植體褐化的主要方式。PPO、POD和PAL被認為是在組培褐變過程中發(fā)揮作用較大的酶，其中PPO是引起酚類物質(zhì)氧化的主要催化酶； PAL是酚類物質(zhì)前體合成中的關(guān)鍵酶，可通過抑制PAL活性，抑制酚類的積累和合成，從而抑制褐變的發(fā)生； POD可在被切割外植體釋放的H2O2作用下促進酚類物質(zhì)氧化導(dǎo)致組織褐變(Pérezetal.， 2012)。

本研究中綜合PVP抑制黑皮油松外植體褐變時間效應(yīng)與酶活作用時間點數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CK處理PPO、PAL活性在8～12天或20～24 天急劇增加，這2個時間點也恰好是外植體褐變愈發(fā)嚴重的時期，而PVP處理在第8 天開始褐變程度明顯輕于對照，與此同時PPO、PAL活性也顯著低于CK處理，說明PVP抑制黑皮油松外植體褐化過程伴隨著PPO、PAL活性降低，PVP可通過抑制PPO活性的增加阻止酚類物質(zhì)的氧化而導(dǎo)致形成醌類物質(zhì)的減少，或者通過影響PAL的活性進而阻止酚類物質(zhì)的合成，最終有效抑制黑皮油松外植體褐變。阿月渾子(Pistaciavera)組培苗(冷平生等， 2012)和葡萄愈傷組織(饒慧云等， 2015)研究中也發(fā)現(xiàn)，PVP處理下PPO活性明顯低于對照，PVP可通過抑制PAL活性增加有效抑制桃(Prunuspersica)果肉褐變(楊青珍等， 2016)。最近芍藥(Paeonialactiflora)研究中也發(fā)現(xiàn)，抑制褐變過程伴隨著PPO、PAL活性的降低(Caietal.， 2020)。對于POD與褐化的關(guān)系說法不一，不同植物材料差異較大。馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖酶促褐變程度與PPO和POD活性顯著正相關(guān)(王麗等， 2019)； 而鳳丹牡丹(Paeoniaostii)愈傷組織褐變與POD活性呈負相關(guān)(毛沛琪等， 2018)。據(jù)此推測在黑皮油松組培中PVP主要通過抑制PPO和PAL的活性來阻止酚酸被氧化或者抑制酚類物質(zhì)的合成，進而阻止黑皮油松休眠芽外植體發(fā)生褐變。因此在今后的黑皮油松組培中可通過抑制PPO、PAL活性以達到抑制褐變的目的。

酚類物質(zhì)作為植物組培中褐變的物質(zhì)基礎(chǔ)，其種類和含量對組織褐變起到至關(guān)重要的作用，酚類物質(zhì)含量越高，褐變越嚴重。本研究PVP處理過程中外植體綠原酸含量顯著高于對照，說明PVP處理對外植體內(nèi)的綠原酸具有保護作用，馬鈴薯(Fengetal.， 2020)和天女木蘭(高紅兵等， 2017)抗褐化研究中也得出類似的結(jié)論。此外，研究發(fā)現(xiàn)添加48.5 mg·L-1阿魏酸能顯著抑制地涌金蓮(Musellalasiocarpa)愈傷組織的褐化，說明阿魏酸在組織培養(yǎng)中具有抗褐化的作用(侯健華等， 2015)。與上述研究結(jié)果類似，在本研究中也證實了阿魏酸具有抑制黑皮油松外植體發(fā)生褐變的作用，本研究中PVP處理與對照0～12 天阿魏酸含量接近，且變化趨勢類似，16～32 天阿魏酸含量顯著高于對照，說明除綠原酸外，PVP處理也可以有效阻止阿魏酸被氧化，進而起到抑制外植體發(fā)生褐變的作用。本研究中香豆酸含量在PVP與對照處理全程均處于較低水平，說明香豆酸可能化學性質(zhì)相對穩(wěn)定不易被氧化，天女木蘭的研究中也得到相似的結(jié)論(高紅兵等， 2017)。綜上得出PVP處理抑制黑皮油松外植體褐變可能主要是通過保護綠原酸和阿魏酸起作用，其中全程對綠原酸起保護作用，而對阿魏酸僅在中后期發(fā)揮作用。

除上述3種酚酸外，本研究同時對沒食子酸、兒茶酚、對羥基苯甲酸、咖啡酸進行了分析，但試驗結(jié)果中僅檢測到了綠原酸、香豆酸和阿魏酸3種酚酸，其余4種酚酸含量過低未檢測出，說明這4種酚酸對黑皮油松外植體的褐化現(xiàn)象影響不大。

4 結(jié)論

300～1 500 mg·L-1PVP處理可以有效抑制黑皮油松休眠芽外植體的褐化，并促進休眠芽萌發(fā)，1 500 mg·L-1PVP為最佳處理濃度?？购只瘎㏄VP通過抑制PPO、PAL活性來阻止黑皮油松外植體發(fā)生褐變。PVP處理抑制外植體褐變與綠原酸和阿魏酸不被氧化有關(guān)，PVP處理可以對綠原酸全程起保護作用，而對阿魏酸僅在中后期起作用。

目前對于抗褐化劑處理抑制外植體褐化的時間效應(yīng)的研究相對較少，本研究探討了PVP抑制黑皮油松外植體褐化的時間效應(yīng)及相關(guān)酶活性、酚酸類物質(zhì)與外植體褐變的關(guān)系，結(jié)果可為黑皮油松組織培養(yǎng)過程中褐變這一瓶頸問題的解決提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。