李琳 余安玲 吳軼 何東 邢新會(huì) 李冰，2? 張霞，2

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510640；3.東莞理工學(xué)院，廣東 東莞 523000；4.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工與化工學(xué)院，廣東 廣州 510006； 5.清華大學(xué) 化學(xué)工程系生物化工研究所，北京 100084；6.清華大學(xué) 工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100084)

白藜蘆醇是一種芪類化合物，其化學(xué)名稱為3，4′，5-三羥基- 1，2-二苯基乙烯。它可在葡萄皮中合成，是葡萄酒和葡萄汁中的重要生物活性成分[1]，具有抗氧化、抗炎[2]、抗癌[3]及保護(hù)心血管等作用[4]。但是，白藜蘆醇等芪類化合物在加熱或紫外光照射下不穩(wěn)定，容易被分解、轉(zhuǎn)化或氧化[5- 6]，這制約了該類化合物在功能食品中的應(yīng)用。將白藜蘆醇與其他天然產(chǎn)物相互作用，從而保護(hù)白藜蘆醇的生物活性，是一種綠色、安全且有效的方法。

果膠是一種酸性雜多糖，廣泛存在于高等植物細(xì)胞初生壁和細(xì)胞間層中，在紫外光照射和熱加工條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[7- 8]。果膠分子鏈中的極性基團(tuán)能夠與白藜蘆醇發(fā)生非共價(jià)結(jié)合，從而保護(hù)白藜蘆醇的活性基團(tuán)，進(jìn)而保護(hù)白藜蘆醇的生物活性[9- 12]。然而，天然果膠的相對(duì)分子質(zhì)量大，大量極性基團(tuán)包裹在分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部，能夠與白藜蘆醇之間形成非共價(jià)作用的位點(diǎn)有限。因此，為了提高果膠與白藜蘆醇的相互作用，有必要對(duì)果膠結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造[10，13]。酶解-超聲耦合改性采用了酶法與物理方法相結(jié)合的方式，是一種降低果膠相對(duì)分子質(zhì)量同時(shí)增加極性基團(tuán)暴露的有效方式[14- 15]。

有鑒于此，文中采用酶解-超聲耦合方法改性果膠，然后將其與白藜蘆醇相互結(jié)合，探討了改性果膠與白藜蘆醇的相互作用機(jī)制，并驗(yàn)證了這種相互作用對(duì)白藜蘆醇經(jīng)紫外光照射和加熱后抗氧化能力的影響，以期為提高該類功能成分在食品應(yīng)用中的穩(wěn)定性提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘果膠、果膠酶(EC 3.2.1.15)、白藜蘆醇，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；甲醇、乙酸、異丙醇(色譜級(jí))，天津市康科德科技有限公司生產(chǎn)；重水(純度99.9%)：北京伊諾凱科技有限公司生產(chǎn)；2，2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鄰苯三酚、奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)；乙酸鈉、硫酸銅、硫酸亞鐵、水楊酸、氫氧化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VCX 500超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，美國(guó)Sonics公司生產(chǎn)；1525高效液相色譜泵、717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器、2414示差折光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司生產(chǎn)；SinChrom ODS-BP C18色譜柱，大連伊力特分析儀器有限公司生產(chǎn)；VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)；AVANCE Ⅲ HD 600核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司生產(chǎn)；EVO 18掃描電子顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司生產(chǎn)；Microcal PEAQ-ITC微量熱等溫滴定量熱儀，美國(guó)Malvern公司生產(chǎn)；Synergy NEO2全功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司生產(chǎn)；WFH- 204B手提式紫外燈，上海精科實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 果膠酶解-超聲耦合改性

將4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)果膠溶解于乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，在pH=4、50 ℃的條件下，用適量果膠酶水解15、30、45 min。水解結(jié)束后，立即沸水浴10 min滅酶活。酶解后將15 mL果膠溶液置于玻璃反應(yīng)器中，在300 W超聲功率下進(jìn)行 10 min 的脈沖超聲處理(脈沖時(shí)間10 s，間歇時(shí)間10 s)，超聲過(guò)程中用冰袋防止樣品升溫。改性果膠依據(jù)酶解時(shí)間不同依次命名為PE15U、PE30U、PE45U，未改性果膠(P)作為對(duì)照。

1.3.2 果膠重均相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

使用凝膠滲透色譜-示差檢測(cè)器聯(lián)用技術(shù)測(cè)定果膠的重均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)。將果膠樣品溶解于流動(dòng)相，質(zhì)量濃度為2～3 g/L。用0.45 μm的水系膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為20 μL，運(yùn)行時(shí)間為35 min。記錄圖譜，在Breeze數(shù)據(jù)處理軟件中用由葡聚糖標(biāo)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行積分，可得果膠的相對(duì)分子質(zhì)量大小及分布。色譜條件：流動(dòng)相為0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液，凝膠柱為Ultrahydrogel 1000(7.8 mm×300 mm)和Ultrahydrogel 500(7.8 mm×300 mm)串聯(lián)使用，流速0.8 mL/min，Waters 2414示差檢測(cè)器，柱溫35 ℃。

1.3.3 果膠甲酯化和乙?；潭鹊臏y(cè)定

采用高效液相色譜技術(shù)測(cè)試果膠的甲酯化程度(DM)和乙?；潭?DAc)。準(zhǔn)確稱量5 mg果膠樣品于2 mL離心管，加入1.5 mL由2 mmol/L CuSO4、0.3 mol/L NaOH和4 mmol/L異丙醇配置的混合液。將懸濁液置于4 ℃下皂化30 min后，高速離心(5 000g，10 min)。取上清液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)至2.0，并在高效液相色譜分析之前用0.45 μm 膜過(guò)濾。將23%(體積分?jǐn)?shù))甲醇、4%(體積分?jǐn)?shù))乙酸和4%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇混勻用作標(biāo)樣。色譜條件：色譜儀為Waters 1525，色譜柱為C18柱(SinChrom ODS-BP、5 μm、250 mm×4.6 mm)，柱溫25 ℃，采用Waters 2414示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)樣體積為20 μL，流動(dòng)相為0.4 mmol/L H2SO4溶液，流速為0.8 mL/min，洗脫時(shí)間為20 min。以異丙醇(IPA)為內(nèi)標(biāo)，依據(jù)甲醇(MeOH)和乙酸(AcOH)的響應(yīng)因子FR，分別計(jì)算果膠樣品的甲酯化程度和乙?；潭?。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜分析

取2 mg凍干果膠樣品與干燥的KBr粉末混勻，在瑪瑙研缽中研磨后，用壓片機(jī)壓片。在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行樣品的紅外光譜掃描，分辨率為4 cm-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用OMNIC軟件進(jìn)行處理與分析。

1.3.5 核磁共振譜圖分析

將15 mg果膠完全溶于0.5 mL重水后置于核磁管中，在25 ℃下用Bruker AVANCE III HD 600核磁波譜儀測(cè)定樣品的1H和13C核磁譜。所有化學(xué)位移均以DDS(δ1H 0.00和δ13C 0.00)為參照，所得譜圖采用MestReNova 9.0.1軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 果膠形貌觀察

將果膠凍干后制成薄片，固定到粘有導(dǎo)電膠的載物臺(tái)上。樣品經(jīng)過(guò)離子濺射儀表面鍍金后，采用掃描電子顯微鏡觀察其表面形貌。

1.3.7 等溫滴定量熱分析

采用等溫滴定微量熱儀(ITC)測(cè)定果膠-白藜蘆醇結(jié)合過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)變化[16]。用含 2 mmol/L 乙酸的緩沖液配制0.5 g/L白藜蘆醇與 5 g/L 果膠溶液，用0.22 μm膜過(guò)濾。取40 μL白藜蘆醇溶液加入滴定針，250 μL果膠溶液加入樣品池中，設(shè)定總滴數(shù)為20滴，每次進(jìn)樣量為2 μL，每隔120 s滴定一次，攪拌速度為500 r/min，DP(Differential Power)值設(shè)為10，樣品池溫度為25 ℃。實(shí)驗(yàn)中儀器自動(dòng)記錄滴定反應(yīng)的熱量-時(shí)間曲線，并將原始數(shù)據(jù)經(jīng)積分后轉(zhuǎn)變?yōu)殪首?摩爾曲線。

ITC測(cè)試中能夠直接得到焓變?chǔ)、結(jié)合常數(shù)KD、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)N，利用MicroCal PEAQ-ITC Ana-lysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，可得到結(jié)合自由能的變化ΔG和熵變?chǔ)。

1.3.8 果膠-白藜蘆醇相互作用后的抗氧化能力分析

果膠-白藜蘆醇復(fù)合物的制備：用30%乙醇溶液將白藜蘆醇配制成濃度為200 μmol/L的溶液，加入到質(zhì)量濃度為4 g/L的等量改性果膠樣品溶液中，經(jīng)兩次30 s漩渦震蕩后制備成果膠-白藜蘆醇復(fù)合物。復(fù)合物的白藜蘆醇終濃度為100 μmol/L，改性果膠的終質(zhì)量濃度為2 g/L。

清除ABTS自由基能力分析：將7 mmol/L的ABTS與過(guò)硫酸鉀溶液按1：1的體積比混合至ABTS終濃度為3.5 mmol/L，靜置12～16 h，形成深綠色的ABTS自由基儲(chǔ)備液。取適量的儲(chǔ)備液，用PBS緩沖溶液稀釋成在30 ℃孵育6 min、波長(zhǎng)734 nm下吸光度為0.7±0.02的工作液。取10 μL樣品濾液，加入200 μL的ABTS自由基工作液，在30 ℃孵育6 min、波長(zhǎng)734 nm條件下，根據(jù)Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的清除ABTS自由基能力。ABTS自由基清除率S按下式計(jì)算：

(1)

式中，D表示吸光度。

(2)

(3)

除未處理樣品外，白藜蘆醇與改性果膠相互作用后的樣品在365 nm的紫外光下照射30 min或在60 ℃水浴加熱30 min后再進(jìn)行抗氧化能力測(cè)試。樣品的抗氧化能力用TEAC(Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity)來(lái)表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。顯著性差異檢驗(yàn)使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS(版本22.0)，當(dāng)P<0.05時(shí)具有顯著性差異。數(shù)據(jù)作圖使用軟件Origin 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解-超聲耦合改性方法對(duì)果膠分子結(jié)構(gòu)的影響

表1所示為改性果膠的重均相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)、甲酯化度(DM)、乙?；?DAc)變化?？梢钥闯觯琈w隨酶解時(shí)間(15～45 min)的延長(zhǎng)逐步降低，經(jīng)15、30、45 min酶解后加超聲處理的果膠的重均相對(duì)分子質(zhì)量分別為原果膠的7%、3%、2%。酶解-超聲耦合改性在較短時(shí)間內(nèi)大幅降低了果膠的相對(duì)分子質(zhì)量，說(shuō)明酶解協(xié)同超聲處理可明顯影響果膠的相對(duì)分子質(zhì)量。在相同的超聲處理?xiàng)l件下，可以通過(guò)控制酶解時(shí)間得到不同相對(duì)分子質(zhì)量分布的果膠水解物。果膠甲酯化度也隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步降低，但酶解30和45 min的樣品的DM沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明，超聲處理可有效降低果膠的相對(duì)分子質(zhì)量和酯化度[17- 19]。超聲波作用于果膠樣品時(shí)，空化效應(yīng)產(chǎn)生的剪切力可通過(guò)機(jī)械效應(yīng)斷裂甲氧基—OCH3中的C—O鍵[20]；同時(shí)，活潑的羥自由基也會(huì)與甲氧基作用生成·OCH3，這兩種效應(yīng)共同作用可有效降低果膠的DM[21]。然而該類耦合改性方法并不能顯著改變果膠的乙?；龋瑥谋?可見，酶解-超聲耦合改性果膠的乙酰化度相比于原果膠沒(méi)有顯著性差異。

表1 改性果膠的Mw、DM和DAc變化1)

圖1 果膠樣品的傅里葉變換紅外光譜

為增強(qiáng)樣品的信號(hào)、降低信噪比，文中在配制核磁樣品時(shí)盡量溶解更多的樣品于重水中。由于果膠樣品相對(duì)分子質(zhì)量和溶解性的差異，最終樣品的濃度并不相同(原果膠樣品濃度<改性果膠PE45U樣品濃度)。因此，文中的1H和13CNMR圖譜均僅用于定性分析。如圖2與表2所示，酶解時(shí)間最長(zhǎng)的改性果膠PE45U與原果膠的1H與13C NMR化學(xué)位移幾近相同，這表明酶解-超聲耦合改性并沒(méi)有改變PE45U果膠分子鏈糖單元中H原子與C原子的化學(xué)環(huán)境，該類改性方法只能夠水解果膠糖單元之間的糖苷鍵結(jié)合，降低果膠的相對(duì)分子質(zhì)量，并不能夠改變糖單元的結(jié)構(gòu)[18- 19，24]。另外，PE15U與PE30U的1H與13C NMR化學(xué)位移同樣與原果膠幾乎沒(méi)有差別(篇幅所限，具體圖譜與數(shù)據(jù)沒(méi)有列出)。

(a)原果膠， 1H NMR

(b)改性果膠PE45U， 1H NMR

(c)原果膠， 13C NMR

(d)改性果膠PE45U， 13C NMR

表2 果膠1H與13C NMR圖譜中信號(hào)的化學(xué)位移

2.2 酶解-超聲耦合改性對(duì)果膠形貌結(jié)構(gòu)的影響

如圖3(a)所示，原果膠的掃描電鏡圖片中有片層絲狀結(jié)構(gòu)存在，且該結(jié)構(gòu)相對(duì)連續(xù)完整。經(jīng)過(guò)45 min酶解-超聲耦合改性以后，原果膠的絲狀結(jié)構(gòu)被打斷，PE45U表現(xiàn)出更多不規(guī)整的“片段化”結(jié)構(gòu)(見圖3(b)、3(c))，這與果膠改性后重均相對(duì)分子質(zhì)量大幅降低(Mw=18 560)的結(jié)果相吻合。原果膠結(jié)構(gòu)“片段化”能夠打破果膠內(nèi)部的氫鍵結(jié)合，為果膠與白藜蘆醇相互作用提供更多的作用位點(diǎn)。

(a)原果膠，1 000倍率

(b)改性果膠PE45U，1 000倍率

(c)改性果膠PE45U，5 000倍率

2.3 酶解-超聲耦合改性果膠與白藜蘆醇的相互作用

依據(jù)等溫滴定量熱曲線(見圖4)計(jì)算出的果膠與白藜蘆醇相互作用的結(jié)合常數(shù)KD與熱力學(xué)參數(shù)如表3所示。果膠經(jīng)45 min酶解-超聲耦合改性后，其與白藜蘆醇的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)N是原果膠與白藜蘆醇結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的24倍，這是由于改性后果膠的相對(duì)分子質(zhì)量減小，暴露出大量的—OH基團(tuán)，提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)。Cheng等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)，果膠與其他分子相互作用的增強(qiáng)主要?dú)w功于極性基團(tuán)的作用，而非相對(duì)分子質(zhì)量的差異。PE45U與白藜蘆醇的結(jié)合常數(shù)不到原果膠與白藜蘆醇結(jié)合常數(shù)的20%，這表明果膠改性后與白藜蘆醇的親和能力大幅增強(qiáng)。白藜蘆醇分子存在—OH基團(tuán)，其與改性果膠主要通過(guò)極性基團(tuán)之間形成氫鍵結(jié)合。根據(jù)焓變?chǔ)與吉布斯自由能ΔG數(shù)值同為負(fù)可知，果膠與白藜蘆醇的相互作用為自發(fā)放熱反應(yīng)，改性后PE45U與白藜蘆醇反應(yīng)放熱的焓變僅為原果膠與白藜蘆醇反應(yīng)焓變的8%。此外，PE45U與白藜蘆醇相互作用的ΔG要低于原果膠與白藜蘆醇相互作用的ΔG，該差異直接證明了改性果膠較原果膠更易與白藜蘆醇發(fā)生相互作用[26]。相較于多酚，多糖對(duì)紫外光與加熱的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性更強(qiáng)，改性果膠與白藜蘆醇發(fā)生結(jié)合將有利于保護(hù)白藜蘆醇在紫外光照射與熱加工時(shí)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

(a)原果膠的熱力學(xué)分析圖

(b)改性果膠PE45U的熱力學(xué)分析圖

(c)原果膠的焓變

(d)改性果膠PE45U的焓變

表3 白藜蘆醇與果膠相互作用的結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

2.4 改性果膠-白藜蘆醇復(fù)合物的抗氧化活性

如圖5(a)和5(b)所示，與白藜蘆醇以及改性果膠相比，白藜蘆醇與改性果膠相互作用后的復(fù)合物清除ABTS自由基和超氧自由基的能力均顯著提高(P<0.05)，這是因?yàn)楦男怨z也具有一定的清除ABTS自由基和超氧自由基的能力，白藜蘆醇與果膠的復(fù)合物能夠提供更高的抗氧化性。由圖5(c)可知，白藜蘆醇與改性果膠相互作用后，清除羥基自由基的能力有所降低(P<0.05)，這是由于白藜蘆醇的抗氧化位點(diǎn)在相互作用過(guò)程中被果膠包埋，不利于其活性發(fā)揮，使其清除羥基自由基的能力下降。從圖5亦可見，不同酶處理時(shí)間的改性果膠-白藜蘆醇復(fù)合物(PE15UR、PE30UR和PE45UR)清除ABTS自由基、超氧自由基和羥基自由基的能力沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。與改性果膠相比，白藜蘆醇具有很高的抗氧化活性，而改性果膠-白藜蘆醇復(fù)合物的抗氧化活性主要由白藜蘆醇決定，所以，不同酶處理時(shí)間所制得的改性果膠對(duì)復(fù)合物的抗氧化性影響較小。

2.5 改性果膠-白藜蘆醇復(fù)合物的紫外光穩(wěn)定性

比較圖5與圖6可知，經(jīng)365 nm紫外光照射后，白藜蘆醇清除ABTS自由基、超氧自由基、羥基自由基的能力均顯著降低，其中清除羥基自由基能力下降程度最為明顯(見圖6(c))。這是因?yàn)榘邹继J醇光穩(wěn)定性差，在紫外光照射過(guò)程中結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)化，進(jìn)而失去抗氧化能力[6]。果膠相較于白藜蘆醇具有更高的紫外光穩(wěn)定性，果膠與白藜蘆醇的相互作用有效保護(hù)了白藜蘆醇的結(jié)構(gòu)，且相較于原果膠-白藜蘆醇復(fù)合物(PR)，改性果膠明顯提高了復(fù)合物經(jīng)紫外光照射后的抗氧化能力。不同酶處理時(shí)間的改性果膠-白藜蘆醇復(fù)合物的抗氧化能力存在差異，這是因?yàn)椴煌柑幚頃r(shí)間的改性果膠的性質(zhì)不同，與白藜蘆醇結(jié)合的程度不同，對(duì)白藜蘆醇結(jié)構(gòu)的保護(hù)程度也不同。

(a)ABTS自由基清除能力

(b)超氧自由基清除能力

(c)羥基自由基清除能力

(a)ABTS自由基清除能力

(b)超氧自由基清除能力

(c)羥基自由基清除能力

2.6 改性果膠-白藜蘆醇復(fù)合物的熱穩(wěn)定性

比較圖5與圖7可知，經(jīng)60 ℃水浴加熱30 min后，白藜蘆醇清除ABTS自由基、超氧自由基的能力有所降低，其中清除羥基自由基能力下降幅度最大(見圖7(c))。這是因?yàn)榘邹继J醇的結(jié)構(gòu)在加熱過(guò)程中被氧化而失去抗氧化能力[6，27- 28]。相比于單獨(dú)的白藜蘆醇及原果膠-白藜蘆醇復(fù)合物，它與改性果膠相互作用后能夠明顯提高其經(jīng)過(guò)加熱后的抗氧化能力。

(a)ABTS自由基清除能力

(c)羥基自由基清除能力

3 結(jié)論

文中采用酶解-超聲耦合法改造了果膠結(jié)構(gòu)，減小了果膠的相對(duì)分子質(zhì)量與甲酯化程度，使其暴露更多能夠與白藜蘆醇發(fā)生氫鍵結(jié)合的作用位點(diǎn)，增強(qiáng)了其與白藜蘆醇相互作用的親和能力。體外實(shí)驗(yàn)表明，改性果膠與白藜蘆醇之間的相互作用能夠保護(hù)白藜蘆醇在紫外光照射和熱加工條件下的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保護(hù)白藜蘆醇的抗氧化能力。下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可對(duì)此作用進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。文中研究為解決白藜蘆醇等芪類功效成分在食品配料應(yīng)用中光穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性差的問(wèn)題提供了新思路。