楊婕琳，陳文婷，胡曉利（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院.消化內(nèi)科 ; 內(nèi)鏡中心, 河北張家口 075000）

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，在疾病早期通常無(wú)明顯的臨床癥狀，即使到了中期也僅會(huì)出現(xiàn)血便、腹痛、排便習(xí)慣改變等缺乏特異度的癥狀，因此疾病的早期確診率低，患者的預(yù)后普遍較差[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與遺傳、飲食、肥胖等多種因素有關(guān)，目前結(jié)直腸癌的具體發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，因此研究與結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)的分子機(jī)制具有重要的意義[2]。硫氧還蛋白-1（thioredoxin-1, TRX-1）以及硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP） 均是硫氧還蛋白系統(tǒng)的重要組成部分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激的作用[3]，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)[4-6]，TRX-1 和TXNIP 與非小細(xì)胞肺癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤密切相關(guān)，二者在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著促癌因子與抑癌因子的作用。炎癥性腸病是結(jié)直腸癌的重要危險(xiǎn)因素，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[7]，TRX-1 在潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸隱窩上皮細(xì)胞中表達(dá)增加，且可促進(jìn)疾病的進(jìn)展。然而目前少有關(guān)于TRX-1 和TXNIP 與結(jié)直腸癌的報(bào)道，二者在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著何種作用尚不明確。本研究旨在探討TRX-1 和TXNIP 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，為研究硫氧還蛋白系統(tǒng)在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用，現(xiàn)將研究報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年1月～12月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者72 例，年齡45 ～70 歲，平均年齡59.84±7.52 歲，男性44例，女性28 例；TNM 分期：I～I(xiàn)I 期48 例，III～I(xiàn)V期24 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42 例；腫瘤大小：<5cm 44 例，≥5cm 28 例；分化程度：中高分化52 例，低分化20 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)臨床病理確診為結(jié)直腸癌；②未并發(fā)其他惡性腫瘤；③入組前未接受任何形式的抗腫瘤治療；④患者及其家屬對(duì)本次研究?jī)?nèi)容均知情，并自愿參與本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)有嚴(yán)重感染者；②心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；③臨床資料不全者；④結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)者。另選同時(shí)期在我院接受治療的結(jié)直腸息肉患者40 例作為對(duì)照組，年齡43～68 歲，平均年齡58.52±6.51 歲，男性26 例，女性14 例。本研究通過(guò)了我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 SP 免疫組化試劑盒，DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；TRX-1 一抗、TXNIP一抗（美國(guó)Zymed公司）；LECIA石蠟切片機(jī)，德國(guó)LECIA公司；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 方法 收集結(jié)直腸癌患者以及結(jié)直腸息肉患者手術(shù)切除的病理標(biāo)本，采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)，常規(guī)石蠟包埋切片，分別采用二甲苯和梯度酒精進(jìn)行脫蠟、水化處理。采用3ml/dl H2O2除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶活性后常規(guī)進(jìn)行抗原修復(fù)。山羊血清封閉后加入稀釋好的一抗（TRX-1 為1:200，TXNIP 為1:400），4℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃溫箱孵育30min。采用DAB 試劑進(jìn)行顯色，蘇木精復(fù)染。分別采用梯度酒精和二甲苯進(jìn)行脫水、透明處理，中性樹(shù)膠封片。

顯微鏡高倍視野下隨機(jī)選取的5 個(gè)不相重疊區(qū)域進(jìn)行觀察，TRX-1 和TXNIP 的陽(yáng)性染色均是細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色顆粒。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)著色0 分，淡黃色1 分，黃色2 分，棕褐色3分。陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：低于5% 0 分，6%～25% 之間1 分，26%～50% 之間2 分，51%～75%之間3 分，75%以上4 分。最終得分為染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)比例得分之和，若最終得分為0 ～1 分則判定為陰性表達(dá)，最終得分為2 ～7 分則判定為陽(yáng)性表達(dá)[8-9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用率的形式描述，采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)分析為spearman相關(guān)檢驗(yàn)。采用接受者工作特征曲線(xiàn)（receiver operation characteristic，ROC）分析TRX-1 和TXNIP對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸息肉組織中TRX-1，TXNIP 的表達(dá)情況 結(jié)直腸癌組織中TRX-1的陽(yáng)性表達(dá)率高于結(jié)直腸息肉組織（66.67% vs 25.00%），TXNIP 的陽(yáng)性表達(dá)率低于結(jié)直腸息肉組織(30.56% vs 77.50%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.880, 22.733，均P<0.05）。

2.2 結(jié)直腸癌組織中TRX-1，TXNIP 的表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。結(jié)直腸癌組織中TRX-1 的表達(dá)與年齡、性別無(wú)關(guān)（P>0.05），與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小以及分化程度有關(guān)（P<0.05）；結(jié)直腸癌組織中TXNIP 的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度無(wú)關(guān)（P>0.05），與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 結(jié)直腸癌組織中TRX-1 和TXNIP 的表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌組織中TRX-1 和TXNIP 表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)spearman 相關(guān)分析顯示，結(jié)直腸癌組織中TRX-1 和TXNIP 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.298，P<0.05）。

2.4 TRX-1，TXNIP 對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值 見(jiàn)表2，圖1。以病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，以結(jié)直腸癌組織中的相關(guān)數(shù)據(jù)為陽(yáng)性樣本，以結(jié)直腸息肉組織中的相關(guān)數(shù)據(jù)為陰性樣本，采用ROC 曲線(xiàn)分析TRX-1 和TXNIP 對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，TRX-1 和TXNIP 對(duì)結(jié)直腸癌均有一定的診斷價(jià)值，曲線(xiàn)下面積分別為0.708 和0.735。聯(lián)合診斷時(shí)存在TRX-1 表達(dá)陽(yáng)性或TXNIP 表達(dá)陰性即判定為結(jié)直腸癌診斷陽(yáng)性，TRX-1 表達(dá)陰性且TXNIP 表達(dá)陽(yáng)性則判定為結(jié)直腸癌診斷陰性。結(jié)果顯示，二者聯(lián)合可進(jìn)一步提高診斷價(jià)值，曲線(xiàn)下面積為0.792，且敏感度有了大幅度的提升。

表2 TRX-1，TXNIP 對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值

圖1 TRX-1，TXNIP 診斷結(jié)直腸癌的ROC 曲線(xiàn)圖

3 討論

結(jié)直腸癌具有較高的發(fā)病率，在世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率排在男性惡性腫瘤中的第三位，女性惡性腫瘤中的第二位[10]。由于發(fā)病早期缺乏特異性癥狀，大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，現(xiàn)有的化學(xué)療法和分子靶向療法等治療效果欠佳，患者預(yù)后普遍較差[11]。癌胚抗原、糖類(lèi)抗原199 等腫瘤標(biāo)志物雖可在早期輔助診斷結(jié)直腸癌，但還是存在部分的誤診和漏診的情況[12]。另一方面，惡性腫瘤的靶向治療在近年來(lái)取得了較大的進(jìn)展，但現(xiàn)有的靶點(diǎn)依然存在較多局限性。研究與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的蛋白，對(duì)尋找新的腫瘤標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)均有重要意義。

TRX-1 是硫氧還蛋白家族的成員之一，由104 個(gè)氨基酸組成，分子量12 kD，其是機(jī)體氧化還原調(diào)控的重要蛋白質(zhì)，可起到抗氧化作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，TRX-1 在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，發(fā)揮著促癌的作用，如楊薈敏等[13]人的研究發(fā)現(xiàn)，TRX-1 在肝癌患者腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且過(guò)表達(dá)TRX-1 可減弱脂連蛋白對(duì)小鼠移植性肝癌生長(zhǎng)的抑制作用；潘濤等[14]人的研究顯示，TRX-1 高表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中TRX-1 的陽(yáng)性表達(dá)率高于結(jié)直腸息肉組織，且高TNM 分期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小≥5cm、分化程度低的結(jié)直腸癌組織中TRX-1 的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，這提示TRX-1 可促進(jìn)結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[15]，TRX-1可促進(jìn)上皮到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的遷移和侵襲；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[16]，抑制TRX-1 的表達(dá)可增強(qiáng)丁酸鈉對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的抑制作用，而過(guò)表達(dá)TRX-1 則可減弱丁酸鈉的抗腫瘤作用；WANG 等[17]人的研究也顯示，TRX-1 抑制劑可有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。由此可見(jiàn)，TRX-1 在結(jié)直腸癌中也是發(fā)揮著促癌作用，抑制其表達(dá)可能是治療結(jié)直腸癌的新思路。

TXNIP 是TRX-1 的配體蛋白，TXNIP 第247位半胱氨酸殘基可與TRX-1 的第32 位半胱氨酸殘基形成穩(wěn)定的二硫鍵[18]，因此，TXNIP 可負(fù)向調(diào)控TRX-1 的表達(dá)，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中TRX-1 和TXNIP 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中TXNIP 的陽(yáng)性表達(dá)率低于結(jié)直腸息肉組織，且低TNM 分期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中TXNIP 的陽(yáng)性表達(dá)率較高，這提示TXNIP 可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，發(fā)揮著抑癌因子的作用。目前較少研究涉及到TXNIP 調(diào)控結(jié)直腸癌進(jìn)展的具體作用機(jī)制，負(fù)向調(diào)控TRX-1可能是其重要的作用機(jī)制之一。LIN 等[19]人的研究發(fā)現(xiàn)，S100P 可通過(guò)負(fù)向調(diào)控TXNIP 的表達(dá)來(lái)促進(jìn)TRX-1 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展。調(diào)節(jié)機(jī)體的抗氧化功能是TXNIP 最主要的生理作用之一，其在與TRX-1 結(jié)合后會(huì)影響機(jī)體的抗氧化性，促進(jìn)活性氧的生成[20]。相關(guān)研究顯示[21]，TXNIP可通過(guò)促進(jìn)活性氧的生成來(lái)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而發(fā)揮抑癌的作用，這可能是其影響腫瘤惡性進(jìn)展的重要作用機(jī)制之一。

此外，本研究通過(guò)ROC 分析發(fā)現(xiàn)，TRX-1 和TXNIP 對(duì)結(jié)直腸癌均有一定的診斷價(jià)值，曲線(xiàn)下面積分別為0.708（95%CI：0.608～0.809）和0.735（95%CI：0.637～0.832）。然而單一指標(biāo)診斷通常具有一定的局限性，結(jié)合多個(gè)相關(guān)的生物標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合診斷是目前的趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示TRX-1和TXNIP 二者聯(lián)合可進(jìn)一步提高診斷價(jià)值，曲線(xiàn)下面積為0.792（95%CI：0.699～0.885），提示兩者也具有成為臨床輔助診斷結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物的潛力。然而本研選取的病例數(shù)較少，該結(jié)論還有待大型研究進(jìn)行驗(yàn)證。另一方面，本研究?jī)H通過(guò)組織學(xué)中的表達(dá)情況分析了TRX-1 和TXNIP 診斷結(jié)直腸癌的潛力，然而實(shí)際臨床中獲得組織樣本后即可通過(guò)病理檢查進(jìn)行診斷，因此研究組織中的表達(dá)對(duì)臨床診斷的輔助價(jià)值有限，在后續(xù)的研究將進(jìn)一步分析血清TRX-1 和TXNIP 對(duì)結(jié)直腸癌的輔助診斷價(jià)值。

綜上所述，TRX-1 在結(jié)直腸癌組織中異常高表達(dá)，TXNIP 異常低表達(dá)，二者的表達(dá)水平均與部分臨床病理參數(shù)有關(guān)，且對(duì)結(jié)直腸癌均有一定的診斷價(jià)值。TRX-1 和TXNIP 有望成為結(jié)直腸癌新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而目前TRX-1 和TXNIP與結(jié)直腸癌的相關(guān)研究較少，尤其是TXNIP，二者在結(jié)直腸癌中的具體作用機(jī)制還有待更多的基礎(chǔ)研究進(jìn)行驗(yàn)證。