姜若超，李蓮芳，李俞鑫，王姝茜，劉暢，黃孝杰，合金鑫

(西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224)

滇油杉(Keteleeriaevelyniana)屬松科(Pinaceae)油杉屬常綠針葉喬木，又名云南油杉、杉松、羅漢松、杉老樹等[1]。滇油杉木材在水下耐腐，為建筑、橋梁、家具等優(yōu)良用材，也是云南高原的鄉(xiāng)土樹種和綠化樹種之一，在地區(qū)林業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)建設(shè)的可持續(xù)發(fā)展中起著重要作用[2-3]。然而，在林業(yè)生產(chǎn)中，由于滇油杉種子成熟于10月且不耐儲(chǔ)藏，天然更新的種子于冬季發(fā)芽，氣溫低，種子發(fā)芽較為困難或發(fā)芽不整齊，后期天然更新幼苗保存率較低；因此，需要通過人工培育營造人工林，恢復(fù)滇油杉植被，發(fā)揮其生態(tài)等功能[4]。已有文獻(xiàn)對(duì)滇油杉的研究僅見于生殖器官發(fā)育及其過程的生物化學(xué)研究[5-6]、群落及其多樣性[7-8]、土壤化學(xué)特性[9]以及林下枯落物與火災(zāi)關(guān)系[10]等方面；苗木培育方面，僅付志高等[11]施肥對(duì)滇油杉野生移栽苗生長的報(bào)道。滇油杉種子發(fā)芽的研究未查及相關(guān)文獻(xiàn)。

外源激素通過影響植物的生理和生化過程，呈現(xiàn)打破種子休眠，促進(jìn)種子發(fā)芽的功能。吲哚乙酸(3-Indoleacetic acid，IAA)和赤霉素(3-Gibberellin,GA3)屬植物激素類，對(duì)種子發(fā)芽具有外源激素的作用[12-15]。余春和等[13]和李霈等[14]分別研究指出，不同濃度的IAA和GA3浸種，均有促進(jìn)光皮樺(Betulaluminifera)和菵草(Albergiaodoffiem)種子發(fā)芽的作用；鄒竣竹等[15]和李先民等[16]研究指出，IAA和GA3浸泡種子，提高野牛草(Buchloedactyloides)和杜鵑紅山茶(Camelliaazalea)種子的發(fā)芽率；張薇等[17]和楊文君等[18]采用低濃度GA3溶液對(duì)云南松(Pinusyunnanensis)種子浸種，具有相同的效果。適宜濃度的外源激素浸種，對(duì)植物種子發(fā)芽具有類似的作用。

殼寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)能促進(jìn)有益微生物的生長，誘導(dǎo)植物的抗病性，從而促進(jìn)種子發(fā)芽[15]。袁建平等[19-20]研究指出，COS浸泡小麥(Triticumaestivum)和玉米(Zeamays)種子，可縮短其種子發(fā)芽時(shí)間；秦艷霞等[21]采用COS溶液浸泡大麥(Hordeumvulgare)種子、張運(yùn)紅等[22]浸泡小麥種子，以及陸建玲等[23]浸泡辣椒(Capsicumannuum)種子，對(duì)發(fā)芽率都具有相似的作用。用COS浸種多個(gè)草本植物，對(duì)其種子萌發(fā)的影響基本類似[19-23]。

參考已有的文獻(xiàn)[13-25]，采用U12*(1212)均勻設(shè)計(jì)的變形U12*(412)均勻設(shè)計(jì)開展IAA、GA3和COS共3因素的不同水平及其組合對(duì)滇油杉種子發(fā)芽影響的試驗(yàn)研究，了解其對(duì)滇油杉種子發(fā)芽的影響，以期為滇油杉的種子生理的研究和苗木培育提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究地和種子概況

試驗(yàn)地位于云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院苗圃(102°76′24″E、25°06′41″N，海拔1 891 m)，屬北亞熱帶氣候類型，年平均溫度14.5 ℃，年最熱月(7—8月)和最冷月(1月)平均氣溫分別為25 ℃和3 ℃，年平均相對(duì)濕度68.2%，年降水量840.3 mm[25]。種子于2019年10月中旬采集自昆明市宜良縣國有花園林場。種子制種后，于4 ℃的冰箱中冷藏6個(gè)月。試驗(yàn)種子的千粒重66.55 g，即每公斤種子有15 000粒。土壤為山地紅壤。

1.2 研究方法

試驗(yàn)包括IAA(A)、GA3(B)和COS(C)3個(gè)因素，每因素含4水平。根據(jù)因素水平表，采用U12*(1212)的變形U12*(412)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素A、B和C分別排列于1、2和6列(表1)。

表1 因素水平和U12*(412)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共12個(gè)處理組合，增加1個(gè)蒸餾水浸種的對(duì)照(CK)；每處理組合50個(gè)無紡布容器，3次重復(fù)。每個(gè)容器播種3粒種子。

基質(zhì)由森林土和珍珠巖按4︰1的比例混合構(gòu)成。無紡布容器上口徑×高為9 cm×13 cm。播種前15 d，按比例配制基質(zhì)并分裝入容器中；分析純IAA和GA3采用上海伯奧生物科技有限公司生產(chǎn)的粉劑，COS采用源葉生物生產(chǎn)的粉劑。按試驗(yàn)方案將IAA、GA3和COS溶解后配制為母液。

播種前1 d，挑選大小一致且種粒飽滿的滇油杉種子，用紗布包裹浸泡于0.5%的高錳酸鉀溶液中消毒0.5 h后，清水沖洗干凈；同時(shí)，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度配制混合溶液。消毒后的種子于IAA、GA3和COS混合溶液中在黑暗環(huán)境下浸種12 h。浸種后的種子播入無紡布容器。播種時(shí)將種子無種翅的一端播入基質(zhì)，播種深度以不見種子，只露出種翅為宜，覆蓋土壤(厚度約0.5 cm)，再于其上覆蓋松針以防澆水導(dǎo)致基質(zhì)表面板結(jié)。播種結(jié)束后澆透水，并于苗床上搭建小拱棚遮陰，遮陰度約90%。種子發(fā)芽期間，適時(shí)澆水保持土壤濕潤，并觀察記錄發(fā)芽狀況。

從發(fā)芽之日開始，每隔2 d記錄1次發(fā)芽種子的粒數(shù)，進(jìn)行發(fā)芽指標(biāo)計(jì)算。相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式如下。

發(fā)芽率(%)=(n/N)×100%

發(fā)芽勢(%)=(N0/N)×100%

式中:n為測定時(shí)間內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)；N為置床的種子數(shù)；N0為日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰時(shí)正常發(fā)芽的種子數(shù)；Gt為第t天正常發(fā)芽的種子數(shù)；Dt為與Gt相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)[26]。

采用Excel軟件和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。為滿足方差分析的齊性要求，如果有數(shù)據(jù)≤30%或≥70%，先進(jìn)行反正弦變換后再進(jìn)行方差分析。處理組合和因素水平間呈現(xiàn)顯著或極顯著的差異，采用鄧肯氏(Duncan’s)[27]法進(jìn)行多重比較，發(fā)芽指標(biāo)間及其與因素間采用Pearson的相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子發(fā)芽過程

播種的滇油杉種子，在場圃條件下，于播種后第26 d開始發(fā)芽，至第81 d結(jié)束發(fā)芽試驗(yàn)，發(fā)芽延續(xù)期達(dá)55 d，但播種29 d后發(fā)芽率急劇下降；處理組合1、2、4、7、9和11在播種后的第26～29 d出現(xiàn)1次發(fā)芽小高峰，此期間，發(fā)芽率為6.7%～17.8%，發(fā)芽較遲的對(duì)照則低于2.2%；播種后42～59 d之間，除對(duì)照外，其余處理組合出現(xiàn)第2次發(fā)芽小高峰，此期間，發(fā)芽率為2.0%～9.6%(圖1)，表明不同處理組合對(duì)滇油杉種子發(fā)芽過程影響程度不同。同時(shí)，于夏天播種，7月正值昆明雨季，氣溫波動(dòng)較大，溫度變化幅度大是否會(huì)導(dǎo)致滇油杉種子發(fā)芽延續(xù)較長時(shí)期和發(fā)芽率低，有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

圖1 滇油杉種子的發(fā)芽過程

2.2 浸種對(duì)種子發(fā)芽的影響

2.2.1 發(fā)芽率和發(fā)芽勢

處理組合的平均發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別為29.8%～69.6%和7.8%～43.5%，對(duì)照的僅為23.6%和5.4%；處理組合2、3、5、6、7和12的發(fā)芽率極顯著地高于其余和對(duì)照的(P=1.54E-04<0.01)；發(fā)芽勢則是2、5、6和10的極顯著地高于其余和對(duì)照組(P=5.12E-05<0.01)；處理組合2和5的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均極顯著地高于其余組合(表2)，表明不同因素水平組合可極顯著地提高滇油杉種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢；0.10 g/L的GA3和0.20%的COS浸種，以及0.10 g/L的IAA、0.15 g/L的GA3和0.05%的COS浸種兩個(gè)處理組合同時(shí)提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢，即低濃度的GA3和相對(duì)較高的COS浸種，低濃度IAA和GA3兩種外源激素與低濃度COS溶液浸種，與前者具有相同的作用。

表2 滇油杉種子發(fā)芽指標(biāo)

影響發(fā)芽率和發(fā)芽勢的主導(dǎo)因子是GA3(表3)。因素水平間，0.10 g/L的GA3浸種的發(fā)芽率和發(fā)芽勢極顯著地高于其余水平的(P發(fā)芽率=0.001<0.01，P發(fā)芽勢=0.003<0.01)，隨著IAA濃度的增加發(fā)芽率和發(fā)芽勢降低，與處理組合中0.10 g/L的IAA與COS共同浸種發(fā)芽率最優(yōu)的結(jié)果具有差異；COS濃度的變化對(duì)發(fā)芽率無明顯的影響，但發(fā)芽勢隨濃度增加略有提高；發(fā)芽率和發(fā)芽勢的理論優(yōu)處理組合為A1B2C4，與此2指標(biāo)實(shí)際最高的處理組合2相一致(表3、圖2)。因素水平的分析結(jié)果亦表明，在場圃條件下，相對(duì)較低濃度的GA3和IAA浸種有利于滇油杉種子發(fā)芽；同時(shí)，低濃度IAA與COS共同浸種提高發(fā)芽率的結(jié)果，也許此二介質(zhì)間具有交互作用。

表3 發(fā)芽指標(biāo)的極差分析

圖2 種子發(fā)芽指標(biāo)隨因素水平的變化

2.2.2 浸種對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時(shí)間的影響

各處理組合的平均發(fā)芽時(shí)間為13～25 d(對(duì)照為26 d)，其中，處理組合1、2、3、11和12的平均發(fā)芽時(shí)間顯著地早于其余處理組合和對(duì)照組(P=0.013<0.05，表2)；影響種子平均發(fā)芽時(shí)間的主導(dǎo)因子是COS，0.05%的COS浸種的平均發(fā)芽時(shí)間顯著地快于其余的(P=0.025<0.05)；其余2因子的水平未對(duì)平均發(fā)芽時(shí)間產(chǎn)生顯著的差異(P=0.311～0.496>0.05)；平均發(fā)芽時(shí)間的理論優(yōu)水平組合為0.1 g/L的GA3和0.05%的COS溶液混合浸種(A1B2C2)，與實(shí)際發(fā)芽時(shí)間最短的處理組合1(A1B1C2)不一致(表2、表3)。種子平均發(fā)芽時(shí)間的結(jié)果表明，低濃度的(0.05%)COS溶液浸種可顯著地縮短滇油杉種子的發(fā)芽時(shí)間。

處理組合的發(fā)芽指數(shù)為5.0～20.7粒/d(對(duì)照為3.74粒/d)，與種子平均發(fā)芽時(shí)間的不同，處理組合2、3、7和12的發(fā)芽指數(shù)極顯著地高于對(duì)照組(P=4.51E-09<0.01，表2)；影響種子發(fā)芽指數(shù)的主導(dǎo)因子與發(fā)芽率和發(fā)芽勢的相同，GA3浸種的發(fā)芽指數(shù)顯著地高于對(duì)照(P=0.047<0.05，表3)，IAA溶液浸種的發(fā)芽指數(shù)較對(duì)照的低，不同濃度COS浸種與對(duì)照未呈現(xiàn)明顯差異；發(fā)芽指數(shù)的理論優(yōu)水平組合為0.10 g/L的GA3和0.05%的COS浸種(A1B2C2)，其與實(shí)際最高的處理組合3一致(圖2、表2)。以上結(jié)果表明：GA3浸種可顯著地提高種子發(fā)芽指數(shù)，與發(fā)芽率和發(fā)芽勢一致。綜合種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽指數(shù)，0.10 g/L的GA3與0.05%的COS浸種有益于種子發(fā)芽，其可作為滇油杉種子場圃發(fā)芽和苗木培育的參考。

2.3 發(fā)芽指標(biāo)間及其與因素間的相關(guān)分析

相關(guān)分析結(jié)果如表4。發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)兩兩間呈極顯著的正相關(guān)(R=0.745～0.880，P=1.62E-12～0.001<0.01)，平均發(fā)芽時(shí)間與因素C(R=0.341，P=0.042<0.05)，以及因素B與因素C間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)(R=0.333，P=0.047<0.05)；與此相反，發(fā)芽時(shí)間與發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)間呈極顯著的負(fù)相關(guān)(R=-0.548～0.646，P=2.10E-05～0.001<0.01；表4)。相關(guān)分析結(jié)果表明：滇油杉種子發(fā)芽過程中，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)趨勢相一致，即3個(gè)指標(biāo)呈現(xiàn)互為促進(jìn)關(guān)系；發(fā)芽時(shí)間與其余3個(gè)種子發(fā)芽指標(biāo)呈極顯著的負(fù)相關(guān)，揭示發(fā)芽時(shí)間延長，此3個(gè)指標(biāo)極顯著降低，此結(jié)果與處理組合及因素水平的分析結(jié)果相一致；縮短滇油杉種子發(fā)芽時(shí)間是提高種子其它發(fā)芽指標(biāo)的關(guān)鍵，外源激素和COS浸種可縮短種子發(fā)芽時(shí)間，提高種子發(fā)芽的其它3個(gè)指標(biāo)。

表4 各指標(biāo)和因素間的相關(guān)性分析

同時(shí)，發(fā)芽指標(biāo)與因素水平間，僅平均發(fā)芽時(shí)間與COS(C)呈顯著地正相關(guān)，即COS濃度越高，種子發(fā)芽時(shí)間越長，與因素水平對(duì)平均發(fā)芽時(shí)間的結(jié)果相一致，結(jié)合平均發(fā)芽時(shí)間與發(fā)芽率等相關(guān)性，滇油杉種子發(fā)芽對(duì)COS浸種的濃度較為敏感，必須通過試驗(yàn)研究獲得最佳濃度方可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。因素間，僅GA3(B)和COS(C)呈顯著正相關(guān)(表4)，即此2種激素共同浸種，可提高種子發(fā)芽指標(biāo)，與處理組合的結(jié)果相一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

張薇等[17]和初叢相等[28]開展IAA溶液對(duì)云南松和珍珠繡線菊(Spiraeathunbergii)浸種試驗(yàn)，證明低濃度溶液浸種促進(jìn)種子發(fā)芽，高濃度則產(chǎn)生抑制作用；余春和等[13]和李霈等[14]通過IAA浸種處理光皮樺和菵草種子，中低濃度的IAA溶液浸種促進(jìn)種子發(fā)芽；閆艷華等[16]研究外源激素浸泡曼陀羅(Daturastramonium)種子，隨IAA浸種濃度升高，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢逐漸提高且均優(yōu)于對(duì)照的。鄒竣竹等[15]和李先民等[16]分別開展GA3和IAA對(duì)野牛草和杜鵑紅山茶種子發(fā)芽的試驗(yàn)，指出IAA不同濃度浸種對(duì)此2種植物種子發(fā)芽無明顯的影響。本研究中，IAA溶液浸種抑制滇油杉種子的發(fā)芽，與已有文獻(xiàn)的結(jié)論相悖，是否由于多因素的因子組合還是物種不同造成的，有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。與其它外源激素相同，GA3亦具有促進(jìn)種子發(fā)芽的作用[12]。張薇等[17]和楊文君等[18]研究GA3浸種對(duì)云南松種子發(fā)芽的影響，結(jié)果指出，0.10 g/L的GA3顯著地促進(jìn)種子發(fā)芽；肖杰等[29]亦采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)開展GA3浸泡紫薇(Lagerstroemiaindica)種子的試驗(yàn)，結(jié)果表明，20～100 mg/L的GA3顯著地提高種子發(fā)芽指標(biāo)；鄒竣竹等[15]采用GA3溶液浸泡野牛草種子，2.0 g/L的GA3溶液浸種顯著地促進(jìn)野牛草種子發(fā)芽，提高發(fā)芽率；李先民等[16]開展同樣的外源激素對(duì)杜鵑紅山茶浸種試驗(yàn)，指出0.6 g/L的GA3溶液浸種顯著地提高種子的發(fā)芽率。本研究中，GA3溶液(0.10、0.15和0.20 g/L)浸種的種子發(fā)芽指標(biāo)均極顯著地高于對(duì)照(P<0.01)，與已有文獻(xiàn)的結(jié)論一致，即種子發(fā)芽對(duì)適宜濃度的GA3溶液浸種有相同的響應(yīng)，但不同植物其種子對(duì)浸種溶液的最佳濃度要求不同。因此，生產(chǎn)實(shí)踐中，采用GA3溶液浸種，有必要針對(duì)不同樹種開展具體的濃度試驗(yàn)，以獲得最佳濃度應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的種子處理中。

郭衛(wèi)華等[30]研究COS浸種對(duì)黃瓜(Cucumissativus)種子發(fā)芽的影響，指出中低濃度的COS浸種可提高種子的自身抗性，從而促進(jìn)其發(fā)芽；秦艷霞等[21]、張運(yùn)紅等[22]和袁建平等[20]研究采用殼寡糖浸泡大麥和小麥種子，0.05%和0.10%的COS浸種顯著地提高發(fā)芽率和加快種子的發(fā)芽時(shí)間；顧麗嬙等[31]研究COS浸種對(duì)番茄(Solanumlycopersicum)種子發(fā)芽的影響試驗(yàn)，結(jié)果與以上文獻(xiàn)結(jié)論類似。本試驗(yàn)中，相對(duì)低濃度的COS浸種可縮短滇油杉種子的發(fā)芽時(shí)間，但與上述文獻(xiàn)也有不同之處，即低濃度0.05%和0.1%的COS浸種可顯著縮短滇油杉種子發(fā)芽時(shí)間但并未明顯地提高種子發(fā)芽率。COS的浸種處理多用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，在林業(yè)上使用較少，是否其對(duì)促進(jìn)植物的發(fā)芽作用較弱或GA3與COS間存在交互作用，尚有待開展更多濃度梯度的混合浸種試驗(yàn)。

3.2 結(jié)論

采用U12*(1212)均勻設(shè)計(jì)的變形U12*(412)開展IAA、GA3和COS浸種對(duì)滇油杉種子發(fā)芽影響的試驗(yàn)。12個(gè)處理組合的平均發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽指數(shù)分別為29.8%～69.6%、7.8%～43.5%、13～25 d和5.0～20.7粒/d(對(duì)照則分別為23.6%、2.4%、26 d和3.74粒/d)，均顯著或極顯著地高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。GA3是影響種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的主導(dǎo)因子，而影響種子平均發(fā)芽時(shí)間的則是COS。0.10 g/L的GA3溶液浸種極顯著地提高種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(P<0.01)，低濃度(0.05%)的COS浸種，顯著地加速滇油杉種子發(fā)芽(P<0.05)。4個(gè)發(fā)芽指標(biāo)間，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)兩兩間呈極顯著地正相關(guān)(R=0.074 5～0.088，P<0.01)；平均發(fā)芽時(shí)間與發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指標(biāo)呈極顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.01)。因素間，相關(guān)分析結(jié)果與處理組合和因素水平分析的結(jié)論相一致，即GA3和COS溶液共同浸種對(duì)種子發(fā)芽具有促進(jìn)作用。綜合種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽指數(shù)最優(yōu)，0.10 g/LGA3+0.05%的COS溶液混合浸種是滇油杉種子場圃發(fā)芽較優(yōu)的措施，可用于生產(chǎn)實(shí)踐中苗木培育的種子處理。